Даю выдержку про движение тромбоцитов и возможность их самостоятельного размножения по ссылке
http://ulmann.strana.de/razm.html
Движение тромбоцитов
Для определения вида движения тромбоцитов нами применялась теория теплового движения. Смещение частиц и их радиус определялся с помощью киносъемки по киноплёнке. Проведённые измерения и анализ заснятого движения показали, что тромбоциты всех форм и размеров, включая пылевидные, обладают способностью к активному движению (см. фото 3,4, 9, 12). Как показали наблюдения, тромбоциты двигаются в основном путём изменения формы своей клетки. При этом по ней при движении пробегает объёмная волна.
Для анализа изменений, происходящих с тромбоцитами при их движении, камеру заполняли кровью, разведённой 3% водным раствором хлористого натря, помещали на предметный столик микроскопа, снабжённый устройством для подогрева, и выдерживали 5 минут при температуре 55 град. С, затем температуру снижали до комнатной.
В процессе нагрева и выдержки тромбоциты размером до 10 мкм принимали круглую форму, толщиной от 1 до 2 мкм. Выросты не всегда удавалось рассмотреть, поверхность их была гладкая. Первые 15-25 минут они двигались, затем замирали. Через сутки было замечено, что в одном из двадцати случаев тромбоциты начинали расти. Это сопровождалось изменением их формы и перемещениями.
Нами отмечалось три варианта изменений, происходящих с тромбоцитами:
А) Форма тромбоцита заметно не меняется в горизонтальном сечении. Происходит изменение толщины клетки от 0,5 до 3 мкм за период от нескольких минут до нескольких часов. Клетка как бы дышит. Оптическая плотность её при этом сильно меняется: при увеличении толщины тромбоцит становится видимым так же, как эритроцит, при уменьшении толщины он быть почти невидимым.
б) Форма тромбоцита круглая в горизонтальном сечении, заметно не меняется. Но у него появляется овальный выступ, размеры которого колеблются от 0 до 1/3 диаметра клетки. Оптическая плотность его меньше оптической плотности самого тромбоцита. Период изменения размеров выступа непостоянен: 10-15 минут он пульсирует с частотой до 1/3 Гц, уменьшаясь или
Увеличиваясь в размерах в 2-3 раза, затем замирает, при этом выступ может исчезнуть на 0,5-2 часа, и всё повторяется. При этом отмечались незначительные перемещения клетки.
в) Форма тромбоцита овальная, может меняться от сильно вытянутой до круглой. Эти изменения сопровождались заметным перемещением клетки. Контрастность таких тромбоцитов очень низкая, стромы эритроцитов видны лучше. При изменении формы клетки по ней пробегает объёмная волна: передняя часть расширяется, задняя сжимается, клетка принимает вид груши, затем расширяется задняя часть-передняя сжимается и т. д.. Оптическая плотность расширенной части выше суженной. При этом может изгибаться ось симметрии клетки.
Через 2-3 суток, в одном случае из ста, наблюдалось разделение таких тромбоцитов на части перешнуровкой. Разделение это не всегда было четко выражено. Но встречались случаи, когда тромбоцит разделялся на две и более клеток овальной формы разных размеров, соединённых между собой тонкими трубочками. Образовывалась своеобразная цепочка, каждое звено которой меняло форму, как описано выше. В результате чего цепочка двигалась, змеевидно изгибаясь, жёсткой синхронизации между колебаниями отдельных звеньев не отмечалось: можно было видеть, что одно или несколько звеньев цепочки не совершают движение вместе с остальными (см. фото 3).
При наблюдении за тромбоцитами в камере через 6 часов после её заполнения свежеприготовленным раствором крови можно было видеть цепочки и палочки, которые двигались без заметного изменения формы отдельных частей, змеевидно изгибаясь. На поступательное движение может накладываться вращательная составляющая. Палочка может двигаться без заметного изгиба и резко менять направление своего движения на противоположное. Скорость достигает 60 мкм/с. Палочки, цепочки и коки могут перемещаться на относительно большие расстояния, находясь в движении до нескольких часов. Наиболее подвижные образования длиной от 10 до 100 мкм, коки двигаются медленно. Длинные менее подвижны, а очень длинные в целом неподвижны, и у них двигаются отдельные части (см. фото 11).
Если палочка или цепочка двигается, змеевидно изгибаясь, то по ней пробегает волна, близкая к синусоидальной, указывающая на отсутствие сильной упругой связи между отдельными частями двигающегося тела. Видимый характер движения может быть описан как результат сложения гармонического колебания, распространяющегося по упругой нити, с колебаниями (как продольными, так и поперечными) отдельных её частей, возбуждаемыми дошедшим импульсом со случайным запаздыванием по фазе, со слабой упругой связью. Иногда наблюдается движение, при котором меняется только часть палочки или цепочки.
Иногда можно заметить изменение формы тромбоцита, сопровождаемое резким рывком, наводящее на мысль, что внутри клетки перемещается нечто более плотное, чем она сама. Это должно сопровождаться перемещением центра масс, что с изменением форм может определять механизм движения клетки.
Поэтому нами сделано предположение, что тромбоциты перемещаются посредством изменения формы клетки и перераспределением плотности. Одновременно из анализа движения можно предположить, что отдельные части цепочек, а возможно палочек и нитей, представляют собой самостоятельные или полусамостоятельные клетки.
Тромбоциты могут засасывать окружающую среду, но выброс не используется в качестве источника реактивной тяги. Наблюдаемое сокращение объема не всегда сопровождается изменением движения.
Рост и поперечное деление тромбоцитов
Как отмечалось выше, через 4-6 часов плотность тромбоцитов в камере устанавливалась на определённом уровне на период до двух недель и более. За этот промежуток времени количество двигающихся тромбоцитов порой снижалось в 10 раз, движение становилось вялым, многие тромбоциты лежали неподвижно на дне камеры. Этот промежуток времени трудно прогнозируем, и чем он определяется нам окончательно установить не удалось.
Период количественной стабильности сменяется периодом увеличения количества тромбоцитов в последовательности, близкой к геометрической прогрессии со знаменателем 2-3, с периодом 4-6 часов. В камере может наблюдаться: увеличение количества свободных тромбоцитов и их рост, или рост и деление палочек и цепочек, прикреплённых к эритроцитам. Растущие и делящиеся тромбоциты находятся в постоянном движении. Если оно и останавливается, то только на небольшой промежуток времени (до 10 минут). Рост и деление неподвижных тромбоцитов нам наблюдать не удалось, поэтому активное движение тромбоцитов можно считать признаком их жизни.
Во втором случае свободные тромбоциты почти не развиваются. Но от поверхности эритроцитов начинают расти тромбоциты в виде цепочек, длиной до 50 мкм. Они часто очень тонкие и малоконтрастные, и лёгкое сотрясение камеры может привести их к распаду (см. фото 2-4). К эритроцитам они прикреплены крепко, при своём движении цепочка за доли секунды способна сдвинуть эритроцит на расстояние равное его радиусу. Эритроцит со временем истощается, и когда от него остаётся только строма, тромбоциты приходят в интенсивное движение и отрываются от него. Обычно у эритроцита остаётся один коковидный тромбоцит (см. фото 6).
Отмечено, что если в первые часы опыта количество свободных тромбоцитов в растворе возрастает мало, раза в 3, то в последствии в основном развиваются тромбоциты, связанные с эритроцитами. Этому способствует присутствие антибиотиков (например, тетрациклин, пенициллин и т. п.) в растворе или увеличение концентрации хлористого натрия.
Период интенсивного роста и деления сменяется периодом количественной стабильности и затем происходит снижение количества активных тромбоцитов с уменьшением их размеров или наоборот с их разрастанием.
Проследим за изменениями, происходящими с тромбоцитом в виде палочки, прикреплённым к эритроциту. В начале наблюдения палочка оптически однородна и почти прозрачна. Она начинает расти в длину. Через некоторое время, около 4 часов, в палочке начинает появляться оптическое уплотнение, занимающее всю центральную часть палочки, вдоль большей оси симметрии. Примерно за 30 минут уплотнение разделяется на части. Их количество и размеры не постоянны. У коротких, толстых палочек - обычно на две части. После окончания разделения оптического уплотнения начиналось деление всей клетки. Поперечная перешнуровка в основном соответствовала разделению средней части. За 4-6 часов процесс завершался, и палочка превращалась в цепочку, состоящую из коков или коротких палочек, соединённых между собой тонкими нитями разной длины (до 2 мкм) и толщины (до 1 мкм). Оптическое уплотнение в центре клетки исчезало. Всё это время периоды покоя сменялись периодами движения. После окончания деления цепочка начинала энергично двигаться. Это движение обычно приводило к разрыву цепочки. Нам не удалось обнаружить разрыва, которому не предшествовало движение. Примерно, в одном случае из ста можно было наблюдать ветвление цепочки. Ветвь в результате роста и деления разрасталась. Только полностью неподвижные тромбоциты не росли и не делились.
Поэтому мы предполагаем, что тромбоциты обладают способностью расти и размножаться путём поперечного деления.
Тромбоциты, которые не растут и не делятся, составляют не самостоятельную разновидность, это просто погибшие клетки
Размножение тромбоцитов почкованием
При наблюдении за культурой тромбоцитов в камере отмечалось образование дочерних
клеток внутри тромбоцитов. При первом рассмотрении этот процесс похож на образование спор у бактерий:
а) Внутри клетки начинает появляться оптическое уплотнение, место его нахождения произвольно по отношению к клетке. Оно перемещается в клетке и выходит наружу, с полярного конца (см. фото 10).
б) Материнская клетка не всегда погибает после выхода дочерних, а продолжает двигаться, расти и поперечно делиться.
в) Образование дочерних клеток наблюдалось как в отдельных тромбоцитах, так и колониях любых видов.
г) Образование дочерних клеток происходит одновременно с ростом и поперечным делением материнских
д) Образование дочерних клеток не определялось ухудшением условий культивирования. Оно часто происходило в свежих пересевах редко наблюдалось в старых культурах.
е) Отмечалась сезонная зависимость: весной и осенью образование дочерних клеток происходит чаще.
На основании вышеизложенного мы предполагаем, что тромбоцитам свойственен второй способ размножения: путём образования дочерних клеток внутри материнской, для колоний тромбоцитов это естественный способ расселения. Образование дочерних клеток и их дальнейшее поведение похоже на образование почек v бродяжек у колониальных сосущих инфузорий, поэтому нами и принят термин ?почка¦ для дочерней клетки тромбоцитов.
Нами выдвигается предположение, что тромбоциты размножаются путём поперечного деления и внутриклеточным почкованием.
Окраска тромбоцитов
Окраска тромбоцитов сопряжена с определёнными трудностями, связанными с плохим проникновением красителей в клетку через мембрану тромбоцитов.
Приготовим мазок крови на обычном стекле. Высушим его на воздухе. Определённый участок сфотографируем. Зафиксируем мазок в смеси спирт-эфир, свежеприготовленной, возможно малого объёма. Высушим и вновь сфотографируем то же место. Окрасим и снова просмотрим тот же участок без иммерсионной системы и с ней. При сравнении окажется, что после проведения каждой операции количество тромбоцитов на мазке уменьшается. Если поместить смесь спирта с эфиром под микроскоп, то можно увидеть в ней подвижные тромбоциты коковидной и палочковидной форм. В капле кедрового масла видны взвешенные тромбоциты. Тоже наблюдается при окраске мазков культуры тромбоцитов.
Для улучшения проникновения краски в тромбоциты мы обрабатывали их парами дихлорэтана. Приготовленный мазок высушивался на воздухе и выдерживался в парах дихлорэтана 3-5 минут, а затем окрашивался обычным способом. При этом происходит гемолиз эритроцитов, и на стромах хорошо видны тромбоциты. Просматривается грануломер. Тромбоциты лучше прикрепляются к стеклу.
Питание тромбоцитов
Клетки, образовавшиеся в результате роста и размножения тромбоцитов, способны всасывать в себя окружающую среду через присоски. Клетки могут прикрепляться, например, к эритроцитам. Цепочка может прикрепляться к эритроциту не только первоначальным своим звеном, но и каждой отдельной частью своей одновременно. Место прикрепления тромбоцитов к эритроцитам может выдержать значительную нагрузку: эритроцит от рывка цепочки может сдвинуться на расстояние, равное своему радиусу, за доли секунды. Наблюдалось прикрепление клеток к стеклу посредством выростов. Клетка совершала при этом вращательное движение, описывая конус с частотой порядка 4 Гц.
Эритроциты, к которым прикреплены тромбоциты, истощаются, а тромбоциты растут и размножаются. Когда от эритроцита остаётся одна строма, нити из тромбоцитов отрываются и могут прикрепиться к непоражённым эритроцитам. Далее всё повторяется. Мембрана клеток плотная, краска проникает плохо. Высокой степени проникновения можно достичь, изъяв жиры из мембраны. Следовательно, для питательных веществ мембрана непроницаема.
Поэтому мы предполагаем, что тромбоциты имеют голозойное питание, и канальцевая система их (43) есть пищеварительный аппарат.
Культивирование тромбоцитов
Культивирование проводилось в пробирке с отводом закрытой резиновой пробкой с отверстием, в которое вставлена стеклянная трубка, доходящая до дна пробирки. Нижний конец трубки имеет отверстие диаметром до 0,01 мм. Снаружи в пробку вставляется керамический бактериальный фильтр для стерилизации воздух. Отвод пробирки закрыт плотной ватной пробкой, и на него надета резиновая трубка, пережатая зажимом. Приготовленный прибор стерилизуется в автоклаве при 1,5 атм. 0,5 часа. Через патрубок отсасывается воздух. Культивирование проводилось также в плоскодонных колбах, закрытых ватно-марлевым тампоном.
Нами производились посевы тромбоцитов на среды:
а) цельная кровь, разведённая водой или 1-5%-ным водным раствором хлористого натрия;
б) мясо-пептодный бульон;
в) солевая основа с альбуминами и углеводами;
г) солевая основа с гемоглобином и углеводами;
д) солевая основа с набором аминокислот и углеводами;
е) указанные выше среды с агар v агаром.
Для посева использовались:
а) цельная кровь;
б) тромбоциты, выделенные из гемолизированной крови;
в) тромбоциты, выделенные из крови, разведённой 1-5%-ным раствором хлористого натрия в воде;
г) тромбоциты, полученные указанными путями и промытые несколько раз 1%-ным водным раствором хлористого натрия или водой.
Выделение тромбоцитов производилось дифференциальным центрифугированием или фильтрацией.
Во всех случаях наблюдалось тоже, что описано выше. При посевах тромбоцитов, выделенных из крови на питательные среды, всегда наблюдался период, когда заметного увеличения количества клеток не происходило и фаз деления обнаружить не удавалось, как и роста. Этот период для больших сосудов больше, чем для камеры, и при обычном методе выращивания в колбах доходит до 4 и больше недель. И то обнаружить рост удаётся не по помутнению среды, а путём рассматривания раздавленных капель или окрашенных (или нет) мазкой в микроскоп.
Тромбоциты в массе своей оседают на дне сосуда, и так как они сильно нуждаются в кислороде, то культивировать их нужно в тонком слое раствора или используя аэрацию с перемешиванием, чтобы помочь тромбоцитам в завершении деления.
Тромбоциты используют кислород, связанный гемогруппой. Для проверки этого предположения мы развели кровь в дистиллированной воде и все гемогруппы связали окисью углерода. При этом оказалось, что тромбоциты выдерживают разрежение до 18 мм рт. ст. . Оказалось, что при связывании гемогрупп развитие тромбоцитов резко замедлялось, они вырастали толще, размножение замедлялось, активность движения также.
Аминокислотный состав синтетической питательной среды для культивирования тромбоцитов был определён так. Нативная кровь была растворена в 2%-ном водном растворе хлористого натрия. Раствор был отцентрифугирован. Полученный фильтрат был 3 раза промыт 2%-ным водным раствором хлористого натрия с применением центрифугирования. Полученный фильтрат, содержащий эритроциты, лейкоциты и тромбоциты, был помещён в дистиллированную воду. При этом концентрация клеток сохранялась на прежнем уровне. Окончательно полученный раствор был выдержан при температуре 37 град. С в течение 6 месяцев, при этом периодически добавлялась АТФ. Через 6 месяцев раствор был пропущен через миллипоровый фильтр 0,3 мкм. Спектральным анализом гемогруппу выявить не удалось. Применение метода распределительной хромотографии на бумаге показало, что в растворе имеется определённый набор аминокислот и легких пептидов. Белков не было. После разложения пептидов путём кислотного гидролиза, был окончательно произведён анализ аминокислот, как количественно так и качественно.
Аминокислотный состав гемоглобина известен, поэтому вычитание из него аминокислот, оставшихся в растворе, дало состав аминокислот, утилизированных тромбоцитами. Следует отметить, что состав неутилизированных аминокислот соответствует избытку аминокислот в крови больных ревматизмом в острой фазе (9).
Солевой состав был выбран на основе общепринятых представлениях об обмене веществ в животных клетках, близко к составу крови. Витамины были выбраны из тех же соображений. Углеводы были определены методом проб. А именно: был приготовлен раствор солей, аминокислот, витаминов и разделён на части, в каждую был добавлен определённый углевод. Были проверены: сахароза, рамноза, дульцит, иозит, мальтоза, маннит, сорбит, ксилоза, лактоза, арабиноза, глюкоза. Лучше всего тромбоциты усваивают маннит, хуже инозит и сахарозу, плохо дульцит, остальные углеводы тромбоциты не используют.
Состав аминокислот на необходимость проверялся мало. Добавление агар-агара в жидкую питательную среду, описанную выше, привело к получению твёрдой питательной среды. При этом установлено, что тромбоциты агар разжижают и могут использовать как источник углеводов.
При культивировании тромбоцитов на твёрдой питательной среде наблюдались отдельные колонии тромбоцитов размером до 5 мм в диаметре. Иногда они были очень мелкие и видны только при просмотре в микроскоп. Форма круглая, полупрозрачные. Поверхность блестящая, гладкая. Структура зернистая. Цвет светло-бронзовый, у молодых заметен только на просвет, они напоминают каплю воды, при условии смачиваемости. Профиль выпуклый, край ровный, при плотном посеве колонии сливаются. Консистенция студенистая. В воде плохо эмульгируют. В толщу агара не развиваются. При нанесении твёрдой среды в камеру для культивирования можно наблюдать активное движение тромбоцитов в колонии под микроскопом.
Для получения тромбоцитов для посева бралось 0,05 мл крови из пальца. Кожу обрабатывали бензином, формалином, спиртом и йодом. Взятие крови проводилось при ультрафиолетовом облучении в настольном боксе, в который вводилась только кисть донора через перчатку. Кровь брали в шприц, содержащий растворитель, полученную смесь перемешивали и переливали в центрифужную пробирку. Раствор крови центрифугировали при ускорении 4 м/с кв 5 минут. Надосадочную жидкость отсасывали, оставляя в пробирке 0,1 мл жидкости. Затем содержимое пробирки перемешивали и переносили в питательную среду. Пробирку, с посеянными в питательную среду тромбоцитами, помещали в термостат в наклонном положении при температуре 37 град С.. Через каждые два часа питательную среду продували воздухом в продолжение 2 минут. Для этого резиновую грушу, выжав из неё воздух, соединяли резиновой трубкой с патрубком пробирки. При освобождении зажима воздух мелкими пузырями проходил через питательную среду из центральной трубки. Пробирка при этом располагалась вертикально. При не полностью расправившейся груше зажим зажимали и пробирку вновь устанавливали в термостат наклонно.
Наличие роста культуры проверяли, наблюдая раздавленную каплю в микроскоп при увеличении в 600 раз. При установлении роста производили посев на агаризированную среду для проверки чистоты и выделения чистой культуры тромбоцитов.
Для этого из пробирки петлёй набирали среду, растирали её по поверхности агара и той же петлёй производили посев тщательным растиранием по поверхности агара в другой чашке. Чашки помещали в термостат при температуре 37 град С. . Через 48 часов наблюдались выросшие колонии в микроскоп при увеличении в 105 раз. Отдельные колонии переносили в пробирку с питательной средой и культивировали как указано выше.
За 48 часов происходило развитие тромбоцитов до плотности 1,2х10 в 1 мл среды. При посеве одной колонии диаметром 4 мм v в 10 мл среды.
Посевом на агаризированные питательные среды тромбоцитов, выделенных из крови, или самой крови, редко удавалось получить рост колоний. Лучшие результаты (50% случаев) получались при тонком посеве с тщательной растиркой. При этом образовывались колонии, растянутые вдоль штриха от шпателя до 0,4 мм, видимые в микроскоп по разжижению агара.
При пересеве хорошо развившихся тромбоцитов на питательные среды жидкие или твёрдые, развитие культуры происходит быстро: за сутки происходило помутнее среды и рост колоний можно было наблюдать невооружённым глазом. Возможно, что длительный период развития культуры тромбоцитов, выделенных из крови, идёт на освобождение тромбоцитов от факторов, существующих в плазме крови и на поверхности тромбоцитов и препятствующих их развитию. Разрушаются эти факторы тромбоцитами или происходит их естественный распад v нужно проверить. Анализ среды, в которой развивались тромбоциты, говорит за то, что тромбоциты способны разрывать любые пептидные связи.
Наличие в крови факторов, тормозящих развитие тромбоцитов. Подтверждается следующими данными:
а) При отмывке тромбоцитов 1%-ным водным раствором хлористого натрия перед посевом из крови на жидкие питательные среды несколько раз этот период сокращается.
б) При посеве тромбоцитов, развившихся в камере или в пробирке, на жидкие или твёрдые питательные среды, этот период отсутствовал.
в) При добавлению в питательную среду, перед посевом тромбоцитов, выделенных из крови, среды, в которой культивировались тромбоциты, этот период сокращался до суток. Среда стерилизовалась фильтрованием.
г) Увеличение плотности посева тромбоцитов, но не крови, приводило к сокращению периода.
Возможно, что тромбоциты выделяют соединения, связывающие или разрушающие факторы крови, препятствующие их развитию.
При культивировании тромбоцитов на жидких питательных средах в камерах и в колбах отмечался рост нитей длиной до 200 мкм при толщине до 3 мкм. Нити имели разделённый грануломер, перетяжки были редки, часть их слабо выражена. Они змеевидно изогнуты и периодически начинали двигаться, иногда удавалось обнаружить с трудом движение только концов.
Нити не всегда были распластаны по дну камеры, иногда ветвились (см. фото 11). Отмечались клубки из переплетённых нитей. Такие же клубки встречались в мазках крови больной ревматизмом в острой фазе.
Нами рассматриваются эти нити как совокупность клеток v колонии, имеющие общий гиаломер со следами незаконченного деления. Отдельные клетки определяются не всегда чётко разделённым грануломером с учётом разной фазы митотического развития. Каждый участок нити способен к самостоятельному росту и делению, причём плоскость деления всех клеток определяется общей осью ориентации. Но это происходит не всегда, что приводит к ветвлению колонии. В результате происходит рост и деление всех участков нити, что хорошо видно при непосредственном наблюдении. В частности, выше описывался процесс роста и деления палочек и цепочек. Если перемешивать среду, то рост нитей не наблюдается, т. е. Перемешивание можно рассматривать как дополнительный фактор, обеспечивающий завершение деления с распадом (в крови это трение при движении крови по капиллярам).
При культивировании на жидких питательных средах в камерах и в колбах наблюдался рост утолщенных палочек длиной до 30 мкм переменной толщины от 4 до 10 мкм, имеющих выросты, по разному ориентированные и различной длины. Рост таких палочек происходит в непрогнозируемом направлении, с преимуществом вдоль большей оси. Наблюдалось ветвление. Гиаломер для светового микроскопа общий, гранулы распределены неравномерно. В средах, подвергнутых перемешиванию, хотя бы аэрацией, палочки с ветвлением не встречались, при прекращении перемешивания образовывались. При внимательном рассмотрении в них можно было заметить мелкие тромбоциты до 0,5 мкм, двигающиеся в гиаломере, отмечался выход их в окружающую среду.
Нами эти палочки рассматриваются, также как и нити, как колонии тромбоцитов, у которых частично потеряна общая ориентация деления.
В культуре тромбоцитов, выращенной на жидких питательных средах, встречаются колонии тромбоцитов, вы которых полностью потеряна ориентация роста и деления. Эти колонии имеют неопределённую, чаще уплощённую форму, имеющую выросты. В оптический микроскоп гиаломер их просматривается почти как однородный, грануломер распределён неравномерно, в гиаломере просматриваются мелкие тромбоциты, двигающиеся внутри колонии, наблюдался выход из неё. При приготовлении мазков чаще всего происходит сворачивание колонии. Наблюдались смешанные колонии.
Что определяет развитие того или иного вида колоний нам установить не удалось.
На фото 10, 12, 13 вы видите изображения тромбоцитов, полученных с помощью электронного микроскопа. Увеличение в 5000 раз. Тромбоциты культивировались на гемолизированной крови 4 недели. Препарат для контрастирования был напылён в вакууме платиной (катодное напыление) под углом падения 70 град. Напыление было произведено тонким слоем для сохранения электронной прозрачности объекта.
На фото 10 зафиксирована цепочка из тромбоцитов. Отчётливо видно непостоянство формы и размеров. Особи имеют неравноценные концы: один овальный, другой тупой, что указывает на их специализацию. Цепочка явно ориентирована.
При анализе фотографий нужно учесть:
При нанесении тромбоцитов на формваровую плёнку она оказалась покрытой слоем белковых молекул, находящихся в растворе, в котором развивались тромбоциты, хотя для их удаления последние промывались дистиллированной водой с последующим центрифугированием три раза.
На препарат трижды воздействовали вакуумом.
Препарат при катодном напылении подвергался тепловому облучению и бомбардировке атомами платины.
Препарат дважды просматривался и фотографировался в электронном микроскопе, при этом подвергался бомбардировке быстрыми электронами. Явные следы указанного есть загиб формваровой плёнки (см. фото 10).
Жгутиков тромбоциты не имеют. Образования, видимые на некоторых фотографиях и напоминающие жгутики, есть трещины (фотографии слегка отретушированы).
Перед нанесением препарата на формваровую плёнку подвижность тромбоцитов была проверена, так что они погибли в процессе фиксации.
В виду отсутствия фотографий микросрезов и из-за малого увеличения сделать заключение о строении мембран и внутриклеточной организации культивированных тромбоцитов не представляется возможным, но некоторые предположения высказать можно:
Контуры клеток нечёткие. Во всех случаях клетка окружена каймой плотной для электронов, плотность её уменьшается к центру клетки. Кайма переходит в светлую замкнутую кривую, не являющуюся подобием границы клетки. Кривая определяет бобовидную область, заполненную веществом с неравномерной плотностью, распределение которой зависит, по-видимому, от стадии развития клетки. У разных клеток оно распределено по-разному, но в основном концентрируется к полюсам контура. Напоминает ядро овулярного типа.
Все клетки, за исключением почек, вытянуты. Полюса их неравноценны. Один овальный, к нему близко примыкает внутренний светлый контур. Противоположный тупой, с неправильными очертаниями, край его далёк от светлого контура. У тупого конца тёмная полоса, окаймляющая клетку, расширяется и плотность её выше, видны складки, перпендикулярно расположенные относительно оси симметрии клетки. У большинства клеток у тупого конца видны образования, напоминающие короткие жгутики с шаровидными утолщениями на конце.
Анализ фотографии 13 свидетельствует о том, что толщина внешнего плотного слоя в узком месте порядка 10000 нм, а известно, что толщина трёхслойных мембран порядка 10 нм, что на три порядка ниже наблюдаемого, даже если предположить наличие четвёртого слоя получается несоответствие, особенно если учесть, что толщина слоя у полюса достигает 500000 нм, что совсем не согласуется с известным о мембранах. Внутренний светлый слой не повторяет контуров клетки и кажется более определённым, бобовидная форма с чёткими очертаниями. Светлая кривая имеет толщину 50000 нм, что опять мало согласуется с известными размерами мембран. Если предположить, что светлая кривая образовалась в результате усушки клетки, то опять получается несоответствие (отсутствия подобия между светлой кривой и границей клетки).
С осторожностью можно предположить, что концы тромбоцитов имеют различные функции. Клетка обладает хотя бы одним ядром, скорее овулярного типа, окружённого относительно тонким слоем цитоплазмы, ограниченной эластичной мембраной.
Свойства культуры тромбоцитов
Определение производилось общепринятыми методами. По Грамму культивируемые тромбоциты окрашиваются положительно.
В клетках и растворе каталаза присутствует, аммиак выделяется, сероводород нет, индол не выделяется. Агар-агар разжижается, возможно, для получения дульцита. В клетках и в колониях имеется гемосидерин. Целлюлоза не обнаружена.
Культивируемые тромбоциты на синтетической питательной среде и сама среда содержат холестерин. Концентрация холестерина в растворе ниже чем в клетках до 40 раз.
Если в кровь, стабилизированную гепарином, ввести культивированные тромбоциты или среду, в которой они культивировались, то происходит свертывание крови, сгусток крови, образовавшийся после введения в кровь культивированных тромбоцитов и оставленный с ними, через сутки начинает растворяться, а через 3-4 суток полностью лизируется.
Добавление эфирной вытяжки из говяжьего мяса в синтетическую питательную среду приводит к тому, что в основном развиваются тромбоциты имеющие грушевидную форму, размером до 5 раз больше, чем тромбоциты, культивируемые без вытяжки. Тоже наблюдается при посеве на мясо-пептодный бульон.
При добавлении в синтетическую питательную среду, содержащую культивированные тромбоциты, свежей крови, тромбоциты в считанные секунды проникают в лейкоциты. Последние расширяются и разрушаются. Это особенно хорошо заметно, если питательная среда истощена.
Культура тромбоцитов сохраняется как в жидкой, так и на твёрдой питательных средах до 5 лет. Если мазок крови на стекле не фиксировать и поместить на хранение в воздушной среде при влажности воздуха 80-90%, то тромбоциты будут развиваться, используя вещества, находящиеся на стеле (3 года). На твёрдой питательной среде (высохшей при влажности воздуха от 80 до 90%) культура тромбоцитов развивалась 15 лет, колонии мелкие, отдельные, количество их увеличилось в 9 раз.
Тромбоциты спор и цист не образуют.
Клетки, полученные в результате культивирования на синтетической питательной среде, выдерживались сутки в растворе дистиллированной воды. Затем помещались в раствор 0,1 моля щавелевой кислоты с углеродом 14. Через 5 минут тромбоциты были отделены центрифугированием. Выделенные тромбоциты были промыты 3 раза в 0.9%-ном водном растворе хлористого натрия и 3 раза дистиллированной водой, посуда каждый раз менялась. Проверка на наличие радиоактивности с помощью счётчиков показала, что она на уровне фона и зафиксировать её удалось только фотографированием следующим образом. Препарат находился на алюминиевой подложке, которая помещалась на фотопластинку для радиоактивных исследований, время экспозиции - одни сутки. Отмытые тромбоциты были помещены в свежую синтетическую питательную среду при 37 град С. наблюдения показали, что по сравнению с контролем меченные тромбоциты первые четыре дня росли и размножались энергичнее, при этом преобладали крупные формы клеток грушевидной формы, а затем культура погибла.
Признаки для идентификации тромбоцитов
(выделены из крови человека и животных)
Особенности морфологии и цитологии
1. Форма и размеры разнообразны: коковидная, палочковидная, имеющая полярные специализированные концы, дисковидная. Могут выпускать псевдоподии. Размеры от 0,4 до 10 мкм.
2. Соединения клеток: клетки могут объединяться или развиваться в колонии: в виде цепочек, которые могут иметь одно или несколько разветвлений, которые могу свою очередь ветвиться; в виде клеток любой формы, имеющих сплошную цитоплазму, в которой могут относительно свободно перемещаться мелкие клетки и выходить из неё. Размеры колоний: цепочки могут иметь длину до 200 мкм, клетки практически неограниченных размеров.
3 . Движение активное в любом возрасте за счёт изменения размеров и формы тела клетки.
4. Жгутиков нет, могут выпускать псевдоподии, с помощью которых могут прикрепляться к лейкоцитам, эритроцитам, друг к другу и к стеклу, например.
5. Питание голозойное. При захватывании пищи размеры увеличиваются, при выбросе объём уменьшается. Пищеварительный аппарат v канальцевая система. Входные отверстия расположены у концов псевдоподий.
6. Имеется грануломер.
7. Цист и спор не образуют.
8. Размножение путём поперечного деления и внутриклеточного почкования.
9. Капсул не отмечено.
10. Граммположительны.
11. Жизнеспособны в 0,1 М растворе соляной кислоты.
12. Могут проникать в лейкоциты.
13. Могут развиваться в лейкоцитах, последние увеличиваются в размерах, появляется подвижность зернистая, в итоге происходит их распад или нет, с выходом тромбоцитов наружу.
14. Мембрана эластична.
Особенности роста на плотной и в жидкой питательных средах
1.Отдельные колонии имеют размер до 5 мм в диаметре. Иногда очень мелкие, различимые в микроскоп. Форма круглая. Полупрозрачные. Поверхность блестящая, гладкая. Структура зернистая. Цвет светло v бронзовый, у молодых заметен только на просвет, они напоминают каплю воды при условии смачивания. Профиль выпуклый. Край ровный. При плотном посеве сливаются. Консистенция студенистая. В воде плохо эмульгируют. В толщу агара не развиваются.
2.При штриховом посеве видны по краям описанные выше колонии, которые сливаются в центре штриха.
3. В жидкой среде образуется равномерное помутнение, очень слабое. С возрастом осаждающееся. При взбалтывании видны хлопья, которые легко разрушаются. Часто, особенно при длительном первоначальном развитии при посеве из крови, рост можно отметить только при рассматривании капли vраздавленной или высушенной.
Физиолого v биохимические признаки
1. Проверен рост на следующих углеводах и спиртах: сахароза, рамноза, дульцит, иозит, мальтоза, маннит, сорбит, ксилоза, лактоза, арабиноза, глюкоза.
2. Используют: маннит, иозит, сахарозу и дульцит.
3. Кислотность понижается.
4. Разжижают агар.
5. Образуется аммиак.
6. Индол не образуется.
7. Каталаза присутствует.
8. Сероводород не выделяется.
9. Растут на синтетической питательной среде, содержащей: гексацианоферрат (11) калия, лейцин, серин, триптофан, цистеин, гистидин, аргинин, глютаминовую кислоту, метионин, пролин, аспарагин, лизин, глютамин, аминоуксусную кислоту.
10. Содержат гемосидерин.
11. Содержат серотонин.
12. Обладают антигепариновой активностью.
13. Вызывают свёртывание крови.
14. Вызывают ретракцию кровяного сгустка.
15. Лизируют тромбы.
16. Содержат холестерин.
17. Нуждаются в кислороде.
18. Растут при температуре от 0 до 42 град С.
19. Чувствительны к радиоактивности.
20. Растут в концентрированном растворе бикарбоната натрия.
21. Растут в концентрированном растворе хлористого натрия.
22. Наличие животных жиров способствует росту.
23. Могут использовать животные белки.
24. Выдерживают высушивание.
25. В крови содержаться вещества, тормозящие их развитие.
26. В крови содержаться вещества, вызывающие реакцию аглюцинации.
27. Срок развития культуры из крови до 4 недель при малой концентрации крови в растворе. Он зависит от состояния здоровья донора, в период ревмоатаки сильно сокращается.
28. Активность их носит сезонный характер. Повышается осенью и весной. В эти периоды размножение происходит в основном за счёт бродяжёк.
29. Активность меняется в течение суток.
30. Чувствительны к химическим неоднородностям. Перепаду электрических потенциалов, изменению освещённости, давлению. При резком изменении этих параметров происходит сокращение клеток.
31. Предположительно относится к царству животных, к типу простейших, к классу инфузорий, к отряду колониальных сосущих инфузорий.
Заключение
Из крови любого человека, применяя общепринятые методы культивирования, можно выделить культуру клеток, способных расти и размножаться путём поперечного деления или внутриклеточного почкования, используя в качестве питательной среды саму кровь, её плазму или цитоплазму форменных элементов крови.
Эта культура крайне полиморфна, и при наблюдении за ростом её на различных средах, включая синтетические, можно провести полное соответствие с тромбоцитами, находящимися в цельной крови. Все наблюдаемые формы являются взаимопереходными.
Биохимические свойства культуры клеток полностью совпадают со свойствами тромбоцитов, которые не имеют плазменного происхождения. В крови существуют антитела к выделяемой культуре.
Одновременно, все морфологические разновидности тромбоцитов способны к росту и размножению, что можно заметить при непрерывном наблюдении за ними. Исключение составляют особи, не способные к активному движению и изменению формы.
Поэтому нами выдвигается предположение, что тромбоциты человека и животных способны к росту и размножению. Они могут вести как приклеточный, так и внутриклеточный паразитизм, образуя колонии, а также существовать в плазме крови и в растворе, содержащем достаточный для них набор питательных веществ.
Выявленные свойства культуры тромбоцитов определяют ряд положений, требующих безотлагательной проверки. Основные из них по мнению авторов:
Возможность образования тромбоцитарных воспалений в любом месте макроорганизма.
Тромбоциты vпотенциальные паразиты кровеносной системы.
Существующая классификация лейкоцитов во многом определяется развитием тромбоцитов в них.
Белки, продуцируемые тромбоцитами, сами тромбоциты или их мембраны, можно использовать в качестве лекарственных препаратов.
В плазме крови содержится только ничтожная часть тромбоцитов.
Тромбоциты и гемостаз.
Пути и средства борьбы с тромбоцитами.
Тромбоциты и ревматизм.
Тромбоциты и костный мозг.
Тромбоциты и костная ткань.
Тромбоциты и воспаление пульпы зуба.
Симбиоз тромбоцитов и макроорганизма.
Установлено, что если проводить противопаразитарное лечение, количество тромбоцитов в крови уменьшается. Может быть они вообще не нужны, т.к. фагоцитируют лейкоциты?
Вход
Регистрация
FAQ
Поиск
