Паразитарная теория рака

Про СК не читает и не использует только ленивый и человек с амбициями, что он все знает. Чтобы доказать роакильность теории достаточно одного повторяемого факта. Фактом можно не верить, но он все равно останется. Кще раз прочтите все ссылки о компонентах СК и читайте результаты его использования. На СК никто еще не пожаловался и понимают, что рак вылечить простыми бесплатными средствами не просто. Мнгоие боятся признаться сами себе, что дело пошло на поправку. Нужно терпение. Шевченко для своего метода установил срок 2 года и запрещает использовать что либо другое взамен или совместно. Мы никаких условий не ставим. Признаков улучшения состояния организма много и если они появились, значит выбрана правильная дорога, а все остальное дело времени. Теория говорит, что с паразитами сразу не справиться. С ними должны бороться все, кто окружает больного и принимать тот же курс лечения. На время лечения нужно выбрать правильный режим питания и использовать продукты, которые лишают паразитов питания и их угнетают. Тут может быть целая наука. Не зря мы говорим о полезных добавках к СК, например хорошо пить корейкую водку с сосновыми иголками, жевать прополис, гудрон и т.п. Чтобы это все делать нужно верить, что главное это подавить паразитов и не давать им развиваться. Тут и пост и голодание пойдет на пользу. Гречневую кашу обязательно вместо БАД-ов. Картошку сырую лучше есть красную. Говорят, в ней больше витаминов и минеральных веществ. Еще нужно делать анализ эритроцитов, чтобы они были правильной формы и не слипались. Читайте письмо Александра и метод Юрия. Они, когда лечились, то верили в необходимость сражаться с паразитами. Они категорически отказались от методов офмедицины. К нам за советом обратились многие и никто не говорит, что СК бесполезный. Мы никого не допрашиваем и ждем, когда сами напишут, если посчитают нужным. Надеемся на сознательность. Критиковать компоненты СК бесполезно, т.к. у нас есть козыри. Плохого мы не посоветуем и все собираем в копилку по крупице. Онкогенетикам давно не верим, а они не могут ответить даже на наши вопросы. Рауль тоже молчит. Он поверил Ревичи и думает, что клетки мутируют. Конечно, не вылечить картошкой клетки, которые мутируют. Наши оппоненты остаются при своем мнении и им не выгодно признавать свои ошибки. Равносильно признать себя дураком. Бог им судья.

_________________
Все приобретенные хронические болезни от паразитов. Интернет победит рак и СПИД!

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА ПЕРЕДАЧУ ПЛАЗМИДНЫХ ГЕНОВ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ БИПЛЕНКАХ

В.В. Тец, д.м.н., профессор, академик РАЕН; Ю.И. Стернин, д.м.н., доцент; Г.В. Тец, к.м.н.; Н.В. Заславская, к.м.н.; Н.К. Артеменко, к.м.н.; Г.Ю. Кнорринг, к.м.н.
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет
им. академика И.П. Павлова, Санкт-Петербургская медицинская Академия последипломного образования

Открытие бактериальных биопленок, образующихся в ходе практически любого инфекционного процесса, показало неизвестные ранее причины недостаточной эффективности использования антибиотиков. Исследования последних лет свидетельствуют, что действие антибиотиков на бактерии в сообществе зависит не только от свойств микроба и антибиотика, но также строения и состава биопленок. Бактерии в биопленках имеют повышенную выживаемость в присутствии агрессивных веществ, факторов иммунной защиты и антибиотиков. В биопленках они выживают в присутствии антибиотиков, добавленных в количестве в 500-1000 раз большем, чем их минимальная подавляющая концентрация.
Микробные биопленки, образованные разными бактериями, имеют сложное строение и включают в себя бактерии, внеклеточный матрикс и поверхностную оболочку, богатую липидами. Установлено, что в основе повышенной выживаемости лежат свойства клеток и внеклеточного матрикса. Устойчивость бактерий в биопленках связывают с уменьшение доступа препарата за счет барьерной функции поверхностной оболочки и компонентов матрикса и образования бактерий, получивших название «персистеры», находящихся в состоянии полной устойчивости практически ко всем препаратам. Также возможным механизмом устойчивости следует признать развитие резистентности, реализуемой за счет передачи хромосомных или плазмидных генов, в том числе – через матрикс биопленок. Недавно было показано, что для повышения эффективности действия антибиотиков можно воздействовать не только на сами бактерии, но и на компоненты матрикса – белки, липиды и нуклеиновые кислоты, например, используя ферменты: протеазы, липазы, нуклеазы. Ранее проведенные нами исследования показали ряд неизвестных эффектов ферментов: способность изменять морфологию и свойства формирующихся микробных биопленок, уменьшать количество матрикса и оптическую плотность колоний, а также усиливать угнетающее действие антибактериальных препаратов.
Свойства бактерий внутри сообщества значительно отличаются от таковых у изолированных клеток. Показано, что биопленка является идеальной нишей для обмена генетической информацией между бактериями. Трансформация в биопленках S.mutans наблюдается в 10-600 раз чаще, чем в планктонных клетках. На модели биопленки была продемонстрирована передача между стрептококками конъюгативного транспозона, кодирующего резистентность к тетрациклину. Передача генетической информации посредством конъюгации в биопленочных культурах P.aeruginosa также наблюдалась чаще, чем среди планктонных клеток.
В связи с этим целью настоящего исследования было изучение возможности влияния на изменчивость бактерий за счет действия экзогенных ферментов на бактериальные биопленки.
Объектом исследования служили стандартные штаммы E.coli HB101, tetR, несущий хромосомный ген устойчивости к тетрациклину и E. coli DH5 alfa, puc 19 ampR, несущие ген устойчивости к ампициллину. Использованы: мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), минимальная синтетическая среда М9, бульон Мюллер-Хинтон (bioMerieux), агар Мюллер-Хинтон (bioMerieux), среда LB (Sigma). В работе использованы различные природные и синтетические антибиотики: ампициллин (Hemofarm DD, Югославия), тетрациклин (BioMerieux, Франция), из ферментных препаратов использовался Вобэнзим (Мукос Фарма, Германия).
Для проверки штаммов и последующего поиска переданных генов методом полимеразной цепной реакции были созданы праймеры для соответствующих генов.
В качестве маркерного признака оценена передача плазмидных генов устойчивости к ампициллину. Оценка передачи устойчивости признака в биопленках после 24 – 48 – 72- 96-120-144 и 168 часов инкубации в присутствии Вобэнзима и без него в качестве контроля.
Для выявления передаваемого признака в генах ДНК матрикса, из смешанных 24-часовых биопленок, разделяли матрикс и клетки центрифугированием при 9000 g в течение 30 минут. Из матрикса выделяли ДНК фенол-хлороформным методом, и после электрофореза в материале полосы, ДНК, по размеру соответствующей плазмиде данного штамма, определяли наличие плазмидных генов методом ПЦР. В результате установлено, что плазмида штамма Escherichia coli DH5 alfa, puc 19, ampR присутствует во внеклеточном матриксе смешанных бактериальных биопленок, может быть выделена из него и идентифицирована методом ПЦР. По данным молекулярного анализа происходит передача плазмиды, контролирующей устойчивость к ампициллину к штамму, несущему ген устойчивости к тетрациклину.
Выявлено, что при действии высоких концентраций Вобэнзима на биопленки различного возраста происходит изменение числа выявления рекомбинантов антибиотикоустойчивости. При этом число рекомбинантов снижается в 2 раза.
Полученные данные свидетельствуют, что ферменты, входящие в состав Вобэнзима, воздействуют на смешанные микробные биопленки. Эти данные подтверждают ранее полученным результаты об универсальности действия различных ферментов, когда объектом воздействия являются не собственно бактерии, а компоненты внеклеточного матрикса биопленок. В матриксе смешанных биопленок однаружена внеклеточная ДНК, несущая маркерные гены антибиотикоустойчивости. При действии ферментов, входящих в состав Вобэнзима, зарегистрировано уменьшение количества внеклеточного матрикса, что очевидно снижает эффективность передачи генов между бактериями биопленок. При этом установлено статистически значимое снижение частоты передачи плазмидных генов антибиотикоустойчивости в бактериальных биопленках использованных штаммов.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о влиянии ферментов на частоту передачи плазмидных генов антибиотикоустойчивости в бактериальных биопленках.

Патент РФ № 2269356
A61K38/43 (2006.01) A61K38/44 (2006.01)
A61K38/46 (2006.01) A61P35/00 (2006.01)

Авторы:
Генкин Дмитрий Дмитриевич,
Тец Виктор Вениаминович,
Тец Георгий Викторович
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Реферат:

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения злокачественных опухолей. Для этого обеспечивают введение в кровь агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови. Этот агент вводят в дозах, обеспечивающих изменение электрофоретического профиля внеклеточной ДНК крови. Агент также можно вводить в дозах и режимах, обеспечивающих уровень ДНК-гидролитической активности плазмы крови, измеряемый в плазме крови и превышающий 150 единиц Кунца на литр плазмы, на протяжении суммарно более 12 часов в сутки. Лечение может осуществляться непрерывно не менее 2 суток. В качестве агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови, может быть использован ДНКаза, в частности, бычья панкреатическая ДНКаза или рекомбинантная человеческая ДНКаза. Способ предполагает также введение агента, связывающего внеклеточную ДНК крови, например, анти-ДНК антитела. Способ обеспечивает малотоксичное и эффективное лечение опухолей, в частности, при длительной, даже пожизненной терапии указанными средствами.

Патент РФ № 2269358
A61K38/47, A61K38/50, A61P3/10, A61P9/10, A61P31/00

Авторы:
Генкин Дмитрий Дмитриевич,
Тец Виктор Вениаминович,
Тец Георгий Викторович

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫХ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ, ИЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ГРИБАМИ И ПРОСТЕЙШИМИ, ИЛИ АТЕРОСКЛЕРОЗА, ИЛИ САХАРНОГО ДИАБЕТА, ИЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С РЕАКЦИЕЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА, ИЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ МУТАЦИЯМИ ГЕНОВ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Реферат:

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения заболеваний, сопровождающихся изменениями внеклеточной ДНК крови, а именно: генерализованных инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, а также заболеваний, обусловленных мутациями генов соматических клеток. Для этого в кровь вводят агент, разрушающий внеклеточную ДНК крови. В качестве такого агента используют ДНКазу, в частности, в дозах, обеспечивающих изменение электрофоретического профиля внеклеточной ДНК крови, выявляемое пульс-гельэлектрофорезом. ДНКазу можно вводить в дозах и режимах, обеспечивающих превышение уровня ДНК-гидролитической активности плазмы крови, 150 единиц Кунца на литр плазмы, на протяжении суммарно более 12 часов в сутки. Способ обеспечивает эффективное лечение указанных заболеваний при отсутствии побочных эффектов.

Выше я представил 2 патента, полученные профессором, д.м.н., заведующим кафедрой микробиологии, эпидемиологии и иммунологии Санкт-Петербургсокого госмедуниверситета В.В.Тецем с сотрудниками.
Как видим, одно и то же средство (нуклеаза, вернее, ДНКза) используется как для лечения онкологии, так и лечения паразитарных болезней, в том числе вызванных и простейшими.
Возникает вопрос, а откуда при болезнях появляются избыточные ДНК? На мой взгляд - это вываливаются в большом количестве те самые "детки" трихомонад. Алексеева их сфотографировала на растровом электронном микроскопе. Впрочем, на тысячах снимках, сделанных на электронных микроскопах их видели еще американцы в 1947 г. и об этом писал академик М.М.Невядомский в своей книге "К вопросу о микропаразитарной теории раковой клетки".

Патент № 2269358
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ВО ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОСТРАНСТВАХ ТКАНЕЙ, И ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЕГО РЕАЛИЗАЦИИ

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения и профилактики широкого круга заболеваний, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов человека. Круг подобных заболеваний широк и включает следующие основные группы заболеваний:

- заболевания пролиферативной природы, сопровождающиеся ускоренным размножением и избыточной гибелью собственных клеток организма, например, опухолевые и гиперпластические процессы; высокое содержание внеклеточной ДНК связано с плохим прогнозом заболевания (Lecomte Т., et al., Detection of free-circulating tumor-associated DNA in plasma of colorectal cancer patients and its association with prognosis. Int J. Cancer 2002 Aug. 10; 100(5):542-8;

- заболевания инфекционной природы, связанные с размножением инфекционного агента, например, бактериальные, вирусные, грибковые, протозойные инфекции, дисбактериозы; внеклеточная ДНК при подобных заболеваниях является либо самостоятельным патогенным фактором, например, в случае инфекций, вызываемых ДНК-содержащими вирусами, либо способствует развитию микроорганизмов, являясь основой внеклеточного матрикса их колоний (Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation, Cynthia В Whitchurch et al., Science. 2002 Feb. 22; 295(5559):1487), участвуя в генетической трансформации микроорганизмов (Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Deitsch K., Driskill С., Wellems Т.: Nucleic Acids Res. 2001 Feb. 1; 29(3):850-3), либо осложняет их течение, формируя основу гнойно-некротических масс (Zaman S., et al. Direct amplification of Entamoeba histolytica DNA from amoebic liver abscess pus using polymerase chain reaction, Parasitol Res. 2000 Sep; 86(9):724-8.); With S.Sherry and L.R.Christensen. Presence and significance of desoxyribose nucleoprotein in the purulent pleural exudates of patients. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1948, 68:179-84;

- заболевания, являющиеся следствием атрофических, дегенеративных и воспалительных изменений в органах и тканях, например, системная красная волчанка; внеклеточная ДНК при этом является одним из ключевых факторов патогенеза заболевания (Pisetsky D.S., Immune response to DNA in systemic lupus erythematosus. Isr Med Assoc J., 2001 Nov.; 3(11):850-3); ДНК, образующееся из гибнущих клеток, может ускорять процессы старения и атрофии тканей человека, US 6524578.

Известны способы лечения ряда из перечисленных заболеваний, путем энтерального применения определенных ферментов; в частности, в патенте СА 2394856 описывают энтеральное введение ферментов, разрушающих поверхностные белки, липиды и углеводороды клеток для лечения инфекционных заболеваний. Этот способ не обеспечивает разрушения дезоксирибонуклеиновых кислот, являющихся одним из основных компонентов как межклеточного матрикса растущих микроорганизмов, так и гнойных детритных масс и, как следствие, данный способ недостаточно эффективен в лечении инфекционных заболеваний.

Известен способ лечения заболеваний, сопровождающихся воспалением, путем орального применения комплекса протеолитических и липолитических ферментов Бромелайн, GB 984464. Применяемые по описанному способу композиции также не содержат ферментов, разрушающих дезоксирибонуклеиновые кислоты. В связи с низкой лечебной эффективностью описанный способ не нашел самостоятельного применения в клинической фармакологии и используется лишь в качестве вспомогательного (Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use, Maurer H.R., Cell Mol Life Sci 2001 Aug 58: pp.1234-45).

Известен способ системной энзимотерапии (СЭТ), основанный на применении композиций протеолитических ферментов, вводимых перорально или в виде клизм в высоких дозах (Wrba, Н. & Pecher, О. Enzymes: A Drug of the Future. Ecomed Verlagsgesellschaft AG & Co., 1993).

Известны также способы лечения заболеваний человека, сопровождающихся воспалением, основанные на энтеральном введении комплекса ферментов, содержащего кроме гликолитических, протеолитических и липолитических ферментов, также и ферменты, разрушающие дезоксирибонуклеиновую кислоту (дезоксирибонуклеазы, ДНКазы), GB 1005985.

В патенте GB 1005985 описан способ лечения воспалительных заболеваний путем орального введения комбинации ферментов, в том числе стептодорназы (стрептококковой ДНКазы) и химических противовоспалительных субстанций; в патенте указано на предпочтительное использование именно протеолитических ферментов, получаемых из поджелудочной железы; также делается вывод об отсутствии влияния дозы используемых ферментов на эффективность лечения.

Среди известных способов лечения, основанных на энтеральном применении ферментов ДНКаз, наиболее близким к заявляемому способу является способ лечения широкого круга заболеваний, сопровождающихся воспалением, основанный на энтеральном введении фермента ДНКазы путем приема таблеток Varidase, содержащих комплекс ферментов стерептокиназы и стрептодорназы (ДНКаз). Способ лечения основан на энтеральном введении от 4 до 8 таблеток Varidase в день для лечения некоторых заболеваний, сопровождающихся воспалением (ROTE LISTE Buch 2004; ISBN 3-87193-286-8, Rote Liste Service GmbH), и получил наибольшее распространение: Continued marketing of a useless drug ('Varidase') in Panama. Lee D., Lancet 1990 Mar, pp.335:667.

Главным недостатком этого способа является его низкая лечебная и профилактическая эффективность как для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, так и для лечения заболеваний других органов, что связано с отсутствием абсорбции фермента в системную циркуляцию. Это отмечается, в частности, в работе: Orally and rectally administered streptokinase. Investigation of its absorption and activity; Oliven A., Gidron E.; Pharmacology, 1981 vol.22: pp.135-8.

Известен лекарственный препарат для орального приема (Varidase), содержащий стрептококковые ферменты стрептокиназу (протеолитический фермент) и стрептодорназу - стрептококковую дезоксирибонуклеазу. Препарат содержит 10000 единиц стрептокиназы и 2500 единиц стрептодорназы в одной таблетке (ROTE LISTE Buch 2004; ISBN 3-87193-286-8, Rote Liste Service GmbH).

Данный препарат принят в качестве прототипа заявленного лекарственного препарата.

Низкая эффективность препарата стала одной из основных причин того, что таблетки Varidase были сняты с производства и отменена их регистрация как лекарственного средства во многих странах мира и, в частности, в США. Одним из основных аргументов являлась их фармакологическая неэффективность (Department of Health and Human Services Food and Drug Administration; Federal Register, Vol.50, N240; Dec.13, 1985).

В основу настоящего изобретения по п.п.1-7 положено решение задачи создания эффективного способа лечения заболеваний человека, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов.

Согласно изобретению (п.п.1-7) эта задача решается за счет того, что в способе лечения заболеваний человека, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов, путем энтерального введения фермента ДНКазы, фермент ДНКазу вводят в дозах от 2000 до 500000 ед. Кунца на 1 кг массы тела в сутки; при этом в способе фермент ДНКаза может быть введен орально; при этом в способе может быть использована лекарственная форма, обеспечивающая освобождение фермента в ротовой полости; при этом в способе может быть использована лекарственная форма, обеспечивающая освобождение фермента в желудке; при этом в способе может быть использована лекарственная форма, обеспечивающая освобождение фермента в тонком кишечнике; при этом в способе может быть использована лекарственная форма, обеспечивающая освобождение фермента в толстом кишечнике; при этом в способе фермент ДНКазы может быть введен ректально.

В основу изобретения по п.п.8-13 положено решение задачи создания лекарственного препарата для реализации заявляемого способа.

Согласно изобретению (п.п.8-13) эта задача решается за счет того, что в лекарственном препарате для лечения заболеваний человека, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов человека, содержащем биологически активное вещество - фермент ДНКазу, содержание фермента ДНКазы в единичной дозе препарата составляет от 50000 до 5000000 ед. Кунца; при этом лекарственный препарат может быть выполнен в виде таблетки для приема через рот; при этом лекарственный препарат может быть выполнен в виде капсулы для приема через рот; при этом лекарственный препарат может быть выполнен в виде суппозитория для ректального введения; при этом лекарственный препарат может быть выполнен в виде жевательной резинки или орально-буккальной пленки, или сублингвальной таблетки; при этом лекарственный препарат может быть выполнен с возможностью дозирования в виде зубной пасты или зубного геля, или порошка, или ополаскивателя полости рта, жевательной резинки, орально-буккальной пленки или сублингвальной таблетки.

Заявителем впервые было установлено, что при энтеральном приеме только высоких доз фермента, превышающих 2000 KU/кг/сутки, наблюдается достоверное увеличение ДНК-гидролитической активности в моче и нарастает содержание в моче иммунореактивного фермента ДНКазы I (таблица 1). Данные изменения имеют в диапазоне доз от 2000 до 500000 KU/кг/сутки доза-зависимый характер. В целом это свидетельствует о том, что при энтеральном приеме высоких доз ДНКазы происходит абсорбция каталитически значимых количеств фермента в кровь. Подобное открытие делает возможным создание эффективных энтеральных лекарственных форм ДНКазы для лечения заболеваний, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов человека, вне пределов пищеварительного тракта.

Благодаря реализации отличительных признаков изобретения достигается важный новый результат: обеспечивается эффективность и безопасность лечения широкого круга заболеваний, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов; кроме того, важным свойством способа является техническая простота реализации изобретения (как способа, так и препарата).

Кроме того, как было установлено заявителями, при осуществлении заявляемого способа для лечения инфекционных заболеваний происходит угнетение формирования биопленок патогенных микрорганизмов, а также подавление возникновения и селекции лекарственно-резистентных клонов микроорганизмов. Данное обстоятельство позволяет использовать заявляемый способ для осуществления контроля за развитием и распространением лекарственной устойчивости среди как нормальной, так и среди патогенной микрофлоры организма человека.

Расчетное количество бычьей панкреатической ДНКазы I активностью 3500 KU/мг (производства Seravac; ЮАР) растворяли в воде и вводили однократно энтерально (per os) 24 здоровым добровольцам (по 3 добровольца на одну дозу). После этого в течение 12 часов осуществляли сбор суммарной мочи; определяли вискозиметрическим методом ДНК-гидролитическую активность мочи, KU на 1 мл суммарной мочи; наличие бычьей сывороточной ДНКазы I в суммарной фракции ДНКазы I определяли по изменению картины электрофореграммы при гель-электрофорезе с изоэлектрофокусированием. Результаты исследования приведены в таблице 1.
Таблица 1
Доза ДНКазы (KU/кг) однократно 0 250 1000 2000 20000 35000 50000 100000 500000
ДНК-гидролитическая активность мочи, KU/мл 0,11 0,13 0,09 0,5 0,9 5,2 10,3 17,0 37,9
Наличие бычьей панкреатической ДНКАзы I в суммарной фракции ДНКазы крови - - - + + + ++ ++ +++


Реализация изобретения по п.п.8-13 иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1.

Твердая дозированная форма ДНКазы для переорального приема следующего состава:
Сухая бычья панкреатическая ДНКаза 100000 ед. Кунца
Магния стеарат 2,5 мг
Микрокристаллическая целлюлоза 50 мг
Лактоза до образования таблетки
массой 200 мг


Лекарственную форму готовят следующим образом: сухую бычью панкреатическую ДНКазу активностью 3500 KU/мг (производства Seravac; ЮАР) (из расчета 100000 ед. Кунца (около 28 мг на 1 таблетку) смешивают с магния стеаратом, смачивают, гранулируют. Смешивают с лактозой и микрокристаллической целлюлозой в количестве, необходимом для получения таблеток массой 200 мг, смесь прессуют в таблетки.

Пример 2:

Капсульная дозированная форма ДНКазы для переорального приема следующего состава:
Сухая бычья панкреатическая ДНКаза 1000000 ед. Кунца
Магния стеарат 2,5 мг
Микрокристаллическая целлюлоза 40 мг


Лекарственную форму готовят следующим образом: сухую кристаллическую бычью панкреатическую ДНКазу активностью 3500 KU/мг (производства Seravac; ЮАР) из расчета 1000000 ед. Кунца (около 280 мг на 1 капсулу) смешивали с магния стеаратом и микрокристаллической целлюлозой, увлажняли, прессовали и гранулировали. Гранулят засыпали в целлюлозные капсулы.

Пример 3.

Мягкая дозированная лекарственная форма для ректального применения следующего состава (на 1 свечу весом 3 г).
Бычья панкреатическая ДНКаза 5000000 ед. Кунца
Твердая жировая основа 1600 мг


Пример 4

Дозированная лекарственная форма в виде пластин для орального использования (жевательная резинка).
Бычья панкреатическая ДНКаза 1000000 ед. Кунца
Резиновая основа 2500 мг
Сахар, декстроза, тапиока, воск до 3000 мг


Реализация заявленного способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 5.

Лечение онкологических заболеваний.

В исследование было включено 9 больных, поступивших в клинику хирургии с диагнозом рецидива рака молочной железы. Всем больным ранее выполнялось оперативное и химио-лучевое лечение заболевания. Всем больным при госпитализации установлены противопоказания к дальнейшему оперативному и химио-лучевому лечению. Все больные имели измеряемые метастазы в печени и/или легких. Все больные дали согласие на осуществление лечения. На момент начала исследования ожидаемая продолжительность жизни больных составляла не менее 3 месяцев.

1 группа больных (3 человека) получала капсулы-плацебо в течение трех месяцев.

2 группа больных (3 человека) получала капсулы по примеру 2 в суточной дозе 5000000 ед. Кунца в течение трех месяцев.

3 группа больных (3 человека) получала таблетки Varidase (производства Wyeth) в максимальной рекомендованной дозе 10 таблеток в сутки (25000IU стрептодорназы в сутки) в течение 3 месяцев.

Одна больная группы 3 была госпитализирована через 9 недель после начала лечения в связи с резким ухудшением самочувствия и прогрессированием метастазирования и скончалась в клинике через 3 дня после госпитализации.

Через 3 месяца после начала лечения больные были повторно госпитализированы. Всем больным была проведена контрольная компьютерная томография, осуществлено клиническое и биохимическое исследование крови, произведена оценка общего состояния по шкале Карновского.

У всех больных групп 1 и 3 отмечено увеличение размеров метастатических узлов в печени и легких, появление новых метастатических очагов, выявлено снижение в среднем на 30% индекса Карновского. У трех больных из пяти заметно ухудшились биохимические показатели крови (снижение содержания альбумина в сыворотке, нарастание гепатоцитолитического синдрома, анемии и биохимических признаков воспаления).

У больных группы 2 при повторном томографическом исследовании не выявлено признаков увеличения размеров ранее имевшихся метастатических узлов и не отмечено появления новых. В одном случае отмечено увеличение индекса Карновского на 40%. У двух других больных индекс Карновского не изменился. Отмечено повышение содержания сывороточного альбумина и гемоглобина крови у всех трех больных.

Пример 6.

Лечение инфекционного мононуклеоза, вызываемого ДНК-содержащим вирусом EBV.

В исследование было включено 20 больных в возрасте от 15 до 28 лет с иммунологически подтвержденным диагнозом инфекционного мононуклеоза. Больные были разбиты на 3 группы:

1 группа больных (8 человек) получала таблетки-плацебо в течение 5 суток и стандартную симптоматическую терапию (глюкокортикоиды и антибиотики).

2 группа больных (6 человек) получала таблетки по примеру 1 в суточной дозе 25000 ед. Кунца на кг массы тела в течение 5 суток.

3 группа больных (3 человека) получала таблетки Varidase (производства Wyeth) в максимальной рекомендованной дозе 10 таблеток в сутки (25000IU стрептодорназы в сутки) в течение 5 суток.

Результаты лечения приведены в таблице 2.
Таблица 2
Синдром Сроки исчезновение синдрома после начала заболевания (сут)
1 группа 2 группа 3 группа
Лихорадка 12 7 11
Периферическая лимфоаденопатия 16 9 17
Тонзилит 15 11 14
Гепатоспленомегалия 17 12 18


Пример 7.

Лечение флегмон челюстно-лицевой области

В исследование было включено 15 больных в состоянии средней тяжести, поступивших в клинику челюстно-лицевой хирургии с диагнозом флегмона челюстно-лицевой области. Больные были разделены на 3 группы:

1 группа больных (5 человек) получала таблетки-плацебо в течение трех суток и стандартную антибактериальную терапию в течение пяти суток (цефотаксим 3 г в сутки внутримышечно).

2 группа больных (5 человек) получала таблетки по примеру 1 в суточной дозе 1500000 ед. Кунца (15 таблеток) в течение 3 суток и стандартную антибактериальную терапию в течение 5 суток (цефотаксим 3 г в сутки внутримышечно).

3 группа больных (5 человек) получала таблетки Varidase (производства Wyeth) в максимальной рекомендованной дозе 10 таблеток в сутки (25000IU стрептодорназы в сутки) в течение 3 суток и стандартную антибактериальную терапию в течение 5 суток (цефотаксим 3 г в сутки внутримышечно).

Результаты лечения приведены в таблице 3.
Таблица 3
Группа 1 Группа 2 Группа 3
Сроки прекращения лихорадки после начала лечения 5 день 2 день 5 день
Сроки очищения раны после начала лечения 7 день 3 день 6 день
Сроки закрытия раны после начала лечения 12 день 7 день 11 день
Наличие резистентных к применяемому антибиотику микроорганизмов 2 из 5 0 1 из 5


Пример 8.

Лечение пародонтита.

В исследование было включено 30 пациентов со средне-тяжелой степенью пародонтита. В начале исследования всем пациентам удаляли зубные отложения и обучали стандартному методу чистки с использованием зубных нитей и межзубных ершиков. Пациенты были разбиты на 3 группы:

1 группа - 10 пациентов в дальнейшем использовали только зубную пасту Колгейт;

2 группа - 10 пациентов в дальнейшем использовали зубную пасту Колгейт и применяли жевательную резинку с ДНКазой по примеру 4 (по 1/4 пластины жевалось в течение 30 минут 4 раза в сутки) в течение 4 недель.

3 группа - 10 пациентов в дальнейшем использовали зубную пасту Колгейт и применяли таблетки Varidase Buccal Tablets в течение 4 недель;

Определяли показатели индекса Силенса и Лоэ (индекс гигиены полости рта) и индекса Мюллермана (индекс кровоточивости десневой бороздки) до начала исследования и его окончании.

Результаты исследования приведены в таблице 4.
Таблица 4
Группы Индексы До лечения После лечения
1 Группа Силенс и Лоэ 1,77±0,27 1,31±0,35
Мюллермана 1,4±0,55 0,65±0,31
2 Группа Силенс и Лоэ 1,78±0,37 0,71±0,38
Мюллермана 1,35±0,б7 0,29±0,21
3 Группа Силенс и Лоэ 1,74±0,35 1,23±0,45
Мюллермана 1,48±0,41 0,8±0,32


Пример 9.

Лечение системной красной волчанки.

В исследование было включено 16 пациентов с установленным диагнозом системной красной волчанки и лабораторными симптомами гломерулонефрита (протеинурия, микрогематурия). Все пациенты получали стандартную терапию (нестероидные противовоспалительные средства, хлороквин). Пациенты опытной группы (8 человек) получали дополнительно свечи по примеру 3 в дозе 250000 ед. Кунца на кг массы тела в сутки на протяжении 15 суток. Изучали концентрацию ДНК в плазме крови до начала лечения и после его окончания. Содержание ДНК в плазме у контрольных больных достоверно не изменилось. У больных опытной группы выявлено двукратное снижение ДНК в плазме крови по окончании 15-дневного курса лечения.

Пример 10.

Лечение возрастного нарушения подвижности сперматозоидов.

В исследование были включены 18 здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 50 до 55 лет. Пациенты были разделены на 3 группы:

1 группа пациентов (7 человек) получала капсулы-плацебо в течение 30 суток;

2 группа пациентов (6 человек) получала капсулы по примеру 2 в суточной дозе 35000 ед. Кунца на кг массы тела в течение 30 суток;

3 группа пациентов (5 человек) получала таблетки Varidase (производства Wyeth) в максимальной рекомендованной дозе 10 таблеток в сутки (25000IU стрептодорназы в сутки) в течение 5 суток.

Исследовали подвижность сперматозоидов в образцах спермы у пациентов в трех группах до начала лечения и по его завершении. До начала лечения процентное содержание подвижных сперматозоидов в образцах спермы у пациентов всех трех групп находилось в пределах 46-54%. Показатели содержания подвижных сперматозоидов у пациентов групп 1 и 3 после лечения не изменились. Содержание подвижных сперматозоидов в образцах спермы пациентов 2-й группы после лечения составило 58-62%.

Пример 11

Влияние заявляемого способа на число выявляемых у больных бактерий-мутантов, устойчивых к рифампицину. Осуществляли посев микрофлоры носоглотки у больного, получавшего лечение рифампицином (1), и больного, получавшего лечение рифампицином парралельно с лечением по заявляемому способу (2). Посевы высевали на агаризованную среду, содержащую рифампицин 50 мкг/мл. Число КОЕ оценивали серийными разведениями с высевами на агаризованную среду без антибиотика (см. табл.5).
Таблица 5
Больной Число КОЕ Число клонов, устойчивых к рифампицину
1 (3,7±0,6)×109 110
2 (2,0±0,1)×108 2-3


Из таблицы 5 видно, что у больного, получавшего антибиотик совместно с лечением по заявляемому способу, высевалось на порядок меньшее число микрорганизмов и среди них всего несколько рифампицин-устойчивых клонов.

Пример 12

Влияние заявляемого способа на число высеваемых у больных мутантов, устойчивых к гентамицину.

Осуществляли посев кала больных, получивших курс лечения гентамицином по поводу острой кишечной инфекции. Посев осуществляли на следующий день после окончания курса лечения. Смешанные культуры выращивали в пробирках как планктонный рост в течение 24 часов. Количество жизнеспособных клеток оценивали по числу КОЕ (колониеобразующих единиц) после 24 часов роста высевами на агаризованную среду, содержащую антибиотик (Км, 50 мкг/мл). В таблице 6 представлены усредненные результаты для группы контрольных больных (Группа А; 3 человека) и группы больных, получавших параллельное лечение по заявляемому способу (Группа Б; 3 человека) (см. табл.6).
Таблица 6
Число КОЕ
Группа А 1,8×1010
Группа Б 2,8×109


Из таблицы 6 видно, что у больных, получавшего антибиотик совместно с лечением по заявляемому способу, высевалось на порядок меньшее число микрорганизмов, устойчивых к гентамицину.


Формула изобретения

1. Способ лечения заболеваний человека, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов, путем энтерального введения фермента ДНКазы, отличающийся тем, что фермент ДНКазу вводят в дозах от 2000 до 500000 ед. Кунца на 1 кг массы тела в сутки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент ДНКазу вводят орально.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют лекарственную форму, обеспечивающую освобождение фермента в ротовой полости.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют лекарственную форму, обеспечивающую освобождение фермента в желудке.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют лекарственную форму, обеспечивающую освобождение фермента в тонком кишечнике.

6. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют лекарственную форму, обеспечивающую освобождение фермента в толстом кишечнике.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент ДНКазу вводят ректально.

8. Лекарственный препарат для лечения заболеваний человека, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов человека, содержащий биологически активное вещество - фермент ДНКазу, отличающийся тем, что содержание фермента ДНКазы в единичной дозе препарата составляет от 50000 до 5000000 ед. Кунца.

9. Лекарственный препарат по п.8, отличающийся тем, что выполнен в виде таблетки для приема через рот.

10. Лекарственный препарат по п.8, отличающийся тем, что выполнен в виде капсулы для приема через рот.

11. Лекарственный препарат по п.8, отличающийся тем, что выполнен в виде суппозитория для ректального введения.

12. Лекарственный препарат по п.8, отличающийся тем, что выполнен в виде жевательной резинки или орально-буккальной пленки, или сублингвальной таблетки.

13. Лекарственный препарат по п.8, отличающийся тем, что выполнен с возможностью дозирования в виде зубной пасты или зубного геля, или порошка, или ополаскивателя полости рта, жевательной резинки, орально-буккальной пленки или сублингвальной таблетки.

В предыдущем патенте надо обратить внимание на следующие слова:
То есть применение такой мочи будет особо эффективным средством. Выходящие с мочой нуклеазы можно опять возвращать в организм.
Мы не знаем, какую еду употребляют йоги, которые живут сотни лет ("Почему йоги живут сотни лет?" - такое название своему интервью газете "Аргументы и факты" дал 10 лет назад д.м.н. Эрнст Мулдашев), но их моча может быть особо полезной хотя бы из-за этих нуклеаз.

Патент № 2269359
A61K38/47, A61K38/50, A61P3/10, A61P9/10, A61P31/00, 61P35/00
Авторы:
Генкин Дмитрий Дмитриевич,
Тец Виктор Вениаминович,
Тец Георгий Викторович
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ РАЗВИТИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ИЛИ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ, ГРИБАМИ И ПРОСТЕЙШИМИ, ИЛИ АТЕРОСКЛЕРОЗА, ИЛИ САХАРНОГО ДИАБЕТА, ИЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С РЕАКЦИЕЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА, ИЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, РАЗВИВАЮЩИХСЯ ВСЛЕДСТВИЕ МУТАЦИИ ГЕНОВ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК (ВАРИАНТЫ)
Реферат:
Согласно первому варианту способа в кровь вводят агент, разрушающий внеклеточную ДНК крови, например ДНКазу. Согласно второму варианту осуществляют введение в кровь агента, связывающего внеклеточную ДНК крови, например анти-ДНК антитела. Согласно третьему варианту в кровь вводят фермент, изменяющий химическую структуру внеклеточной ДНК крови. Согласно четвертому варианту осуществляют введение в кровь агента, стимулирующего синтез и/или активность эндогенной дезоксирибонуклеазы, или агент, стимулирующий синтез антител, связывающих внеклеточную ДНК крови. Способ обеспечивает эффект лечения указанных заболеваний при отсутствии побочных эффектов при длительном использовании препаратов, воздействующих на внеклеточную ДНК крови.
Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для профилактики онкологических заболеваний или инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, развивающихся вследствие мутаций генов соматических клеток.
Перечисленные заболевания являются в совокупности основными причинами, приводящими к инвалидизации и смертности. В настоящее время общепринятой является концепция предпочтительности профилактического вмешательства (предотвращения развития заболевания или его рецидива) по отношению к лечению уже развившегося заболевания или его рецидива. В соответствии с этим интенсивно используются известные и постоянно разрабатываются новые способы лекарственной профилактики развития и рецидивирования перечисленных заболеваний.
Общепризнано, что вакцинация является эффективным и надежным способом профилактики и рецидивирования инфекций, однако эффективные вакцины в настоящий момент удалось создать лишь для профилактики очень ограниченного круга бактериальных, паразитарных и грибковых инфекций, см. G.Ada, A.Ramsey; Vaccines, Vaccination and the Immune Responce; Lippincott-Raven, NY, 1997. В отношении большинства клинически актуальных инфекций единственным способом профилактики в настоящий момент остается способ химиопрофилактики. В качестве примеров можно привести химиопрофилактику широко распространенной инфекции, вызываемой простейшими малярии препаратами хлороквин и мефлоквин, см. Merck Manual of Diagnosis and Therapy; 16th Edition.
Известным способом химиопрофилактики является профилактика антибиотиками и сульфаниламидными препаратами бактериальных инфекций, см. Merck Manual of Diagnosis and Therapy; 16th Edition, а также профилактика грибковых инфекций у больных с иммунодефицитом препаратом Амфотерицин, см. Prophylaxis and treatment of fungal infections associated with haematological malignancies. Sibel Ascioglu et.al., International Journal of Antimicrobial Agents, Volume 15, Issue 3, July 2000, Pages 159-168.
Основным способом лекарственного лечения атеросклероза является терапия препаратами группы статинов - ингибиторами 3-гидрокси-3-метилглютарил коэнзим A(HMGCoA) редуктазы (Ловастатин, Парвастатин и др.), подавляющих синтез холестерина в организме и приводящих к ускорению клиренса липопротеинов низкой плотности из плазмы крови, что замедляет развитие атеросклероза, см. New Concepts and Paradigms in Cardiovascular Medicine: The Noninvasive Management of Coronary Artery Disease, K. Lance Gould, THE AMERICAN JOURNAL OF MEDICINE, Volume 104, June 22, 1998, 2s-17s.
Лекарственные способы первичной профилактики онкологических заболеваний с доказанной эффективностью (за исключением способов первичной профилактики редких специфических форм раковых заболеваний) не разработаны (Enzyme Induction and Dietary Chemicals as Approaches to Cancer Chemoprevention: The Seventh DeWitt S. Goodman Lecture. Allan H. Conney, Cancer Research, vol.63, pp.7005-7031, November 1, 2003). Для предотвращения рецидивирования онкологических заболеваний широко используются способы, основанные на противоопухолевой химиотерапии, иммунотерапии и гормонотерапии, см. Adjuvant treatment for colorectal cancer.,Van Laethem JL, Acta Gastroenterol Beig 2001 Jul-Sep 64: 263-7; Adjuvant therapy for breast cancer patients: treatment decision tree from a French cancer network, Bachelot T, et.al., Bull Cancer, 2002, Oct 89: pp.897-903, используемые в так называемом "адъювантном режиме".
Лекарственных способов профилактики диабета с доказанной эффективностью также не существует. Известны попытки осуществлять профилактику диабета I типа в группах высокого риска с помощью инсулинотерапии, см. Effects of insulin in relatives of patients with type 1 diabetes mellitus., New Engi J Med 2002 May 346: pp.1685-91, и диабета II типа в группах высокого риска препаратами бигуанидов, см. Metfbrmin & lifestyle intervention prevent Type 2 diabetes: lifestyle intervention has the greater effect., Doggrell SA, Expert Opin Pharmacother, 2002, Jul 3: pp.1011-3.
Наиболее распространенным способом профилактики реакций, связанных с гиперчувствительностью замедленного типа, является способ, основанный на терапевтической иммуносупрессии препаратом циклоспорин, см. Therapeutic Immunosupression, ed. A.W.Thomson, Ser. Immunology and Medicine vol.29, Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, 2001.
He существует способов лекарственной профилактики заболеваний, развивающихся вследствие мутаций генов соматических клеток. (Youssoufian H, Pyeritz RE. Mechanisms and Consequences of Somatic Mosaicism in Humans, Nature Reviews Genetics, 2002; 3:748-758).
Анализируя лечебные свойства известных способов профилактики рассматриваемых нами заболеваний, можно выделить следующие основные их недостатки:
1. Рассмотренные способы проявляют токсичность или вызывают развитие осложнений (Адъювантная химиотерапия опухолевых заболеваний, терапевтическая иммуносупрессия циклоспорином, профилактика препаратами статинов).
2. Рассмотренные способы недостаточно эффективны или теряют свою эффективность в процессе длительного применения (инсулинопрофилактика, бигуаниды, статины, противоопухолевые препараты, средства химиопрофилактики инфекций, противоопухолевые препараты, циклоспорин).
3. Рассмотренные способы проявляют активность внутри узкого круга заболеваний или даже в отношении отдельных форм одного и того же заболевания.
В настоящее время отсутствуют какие-либо способы, которые позволяли бы осуществить профилактику указанных выше заболеваний в комплексе, а также предотвращать их рецидивы. В связи с этим отсутствует возможность принять какое-либо известное техническое решение за прототип настоящего изобретения.
В основу всех вариантов настоящего изобретения положено решение задачи создания нетоксичного и эффективного способа для длительного профилактического и противорецидивного применения при заболеваниях, сопровождающихся изменениями качественного и/или количественного состава внеклеточной ДНК крови, а именно: онкологических заболеваний, инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, атеросклероза, сахарного диабета, аллергических заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, заболеваний, развивающихся вследствие мутаций генов соматических клеток.
Согласно первому варианту изобретения эта задача решается за счет того, что в кровь вводят агент, разрушающий внеклеточную ДНК крови; агент, разрушающий внеклеточную ДНК крови, может вводиться пожизненно; в качестве агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови, может использоваться фермент ДНКаза;
согласно второму варианту изобретения эта задача решается путем введения в кровь агента, связывающего внеклеточную ДНК крови; в качестве агента, связывающего внеклеточную ДНК крови, могут быть использованы анти-ДНК антитела;
согласно третьему варианту изобретения эта задача решается путем введения в кровь фермента, изменяющего химическую структуру внеклеточной ДНК крови;
согласно четвертому варианту изобретения эта задача решается путем введения в кровь агента, стимулирующего синтез и/или активность эндогенной дезоксирибонуклеазы, или агента, стимулирующего синтез антител, связывающих внеклеточную ДНК крови.
Развитие и рецидивирование рассматриваемых заболеваний сопровождается качественными и количественными изменениями внеклеточной ДНК крови, однако в известных заявителю источниках отсутствуют знания о генетическом репертуаре внеклеточной ДНК крови больных при рассматриваемых заболеваниях, биологической роли внеклеточной ДНК крови при рассматриваемых заболеваниях и возможном терапевтическом эффекте ее уничтожения для профилактики развития и рецидивирования этих заболеваний.
Как установили заявители, внеклеточная ДНК крови больных при рассматриваемых заболеваниях содержит уникальный по своему качественному и количественному составу репертуар генов и регуляторных генетических элементов, резко отличающийся от репертуара ДНК, описанного в геноме человека. В отличие от внутриклеточной ДНК, внеклеточная ДНК крови больных рассматриваемыми заболеваниями содержит, в основном, уникальные гены человека. Установлено наличие бактериальной внеклеточной ДНК и внеклеточной ДНК грибов в составе матрикса биопленок и в плазме крови инфицированного человека.
Установлено, что внеклеточная ДНК крови, включая внеклеточную ДНК бактерий, грибов и паразитов, при рассматриваемых заболеваниях способствует их развитию и рецидивированию.
Установлено, что разрушение, а также модификация и связывание внеклеточной ДНК крови при рассматриваемых заболеваниях приводит к профилактическому и противорецидивному эффектам.
Указанные выше новые свойства заявленного изобретения, базирующиеся на принципиально новых представлениях о роли внеклеточной ДНК плазмы крови в развитии рассматриваемых заболеваний и их рецидивировании, позволяют сделать вывод о соответствии заявленного способа критерию "изобретательский уровень".
Заявленный способ реализуется следующим образом.
Профилактика прогрессирования злокачественных опухолей.
В исследование включили 9 больных различными формами злокачественных опухолей (рак молочной железы - 2; рак желудка - 3; рак легкого - 4), поступивших в клинику торакальной хирургии после предыдущего неэффективного химиолучевого лечения. У всех больных на момент начала лечения имелись признаки быстрого роста метастазов (по данным повторных компьютерных томограмм). Все больные получили 30-дневный курс лечения ДНКазой I ежедневно внутривенно в виде шести 30-минутных инфузий в сутки в суточной дозе 2100000 единиц Кунца. При последующем контрольном компьютерно-томографическом исследовании лишь у двух больных было выявлено прогрессирование заболевания. У этих же больных выявлялось нарастание количества внеклеточной ДНК крови и определялись высокие титры антител к ДНКазе I. У всех остальных больных произошло отчетливое снижение уровня внеклеточной ДНК крови (фиг.4).
Пример 12.
Профилактика прогрессирования сахарного диабета и атеросклероза
В продолжающееся исследование включено 10 больных с установленным диагнозом диабета 2 типа. Все больные ранее были переведены на лечение рекомбинантным человеческим инсулином длительного действия в связи с невозможностью обеспечить нормогликемию с помощью оральных противодиабетических средств. Средний возраст больных составил 54 года. Средняя длительность заболевания от момента постановки диагноза составила 4,5 года. Пятерым больным опытной группы были прописаны внутримышечные инъекции бычьей панкреатической ДНКазы в дозе 200 мг в сутки (две инъекции в сутки) на протяжении 6 месяцев. Исследовали содержание гликозилированного гемоглобина в крови, индекс атерогенности липопротеидов крови (как показатель активности атерогенеза; известно, что сосудистые осложнения диабета закономерно возникают вследствие быстро развивающегося атеросклероза крупных артерий). Вычисляли суточную потребность в инсулине (как показатель активности основного заболевания).
Эффект лечения ДНКазой на метаболические показатели в группе пациентов, получавших лечение по заявляемому способу.
Двум больным опытной группы до начала исследования была произведена перфузионная сцинтиграфия миокарда с таллием 201 в связи с подозрением на коронарный атеросклероз и "безболевую" форму ишемической болезни сердца. У обеих больных были выявлены диффузно-очаговые зоны с нарушенным накоплением радиофармпрепарата, свидетельствующие о наличии коронарного атеросклероза. Больным была прописана стандартная терапия (бета-блокаторы + нитраты). По завершении исследования больные были направлены на повторную перфузионная сцинтиграфию миокарда. В динамике отмечено улучшение картины накопления радиофармпрепарата в миокарде, свидетельствующее об улучшении кровотока в бассейне коронарных артерий.
Пример 13.
Профилактика рецидивирования злокачественных опухолей В сентябре - октябре 2003 года в клинике торакальной хирургии трем больным (2 мужчин в возрасте 47 и 55 лет и одной женщине в возрасте 51 года) с диагнозом рака легкого в стадии T4N2M+ были произведены паллиативные операции удаления пораженного легкого с иссечением одиночных метастатических узлов в противоположном легком. Все больные ранее получали химиотерапевтическое и лучевое лечение. После операции всем больным с их согласия были прописаны ежедневные внутримышечные инъекции депонированной пролонгированной ДНКазы в дозе 5000000 Единиц Кунца в сутки. К настоящему моменту (срок наблюдения - 10 месяцев, контрольные обследования через каждые 2 месяца) ни у одного из наблюдаемых больных не обнаружено признаков рецидивирования рака легкого. В то же время данные ретроспективного контроля свидетельствуют о том, что вероятность развития рецидива к данному сроку и в данной клинической ситуации приближается к 100%.
Пример 14. Профилактика бактериемии.
В исследование было включено 10 больных, обратившихся в стоматологическую клинику по поводу острой зубной боли. Всем больным был установлен диагноз острого гнойного верхушечного периодонтита и показано удаление больного зуба. Больные были разделены на 2 группы по 5 человек. С согласия больных опытной группы за 30 минут до операции им внутривенно однократно вводили ДНКазу I в дозе 2000000 Единиц Кунца. Через 2 часа после операции у всех больных осуществлялся посев крови. У 5 больных опытной группы посев оказался стерильным. У 3 больных контрольной группы из крови был высеян Streptococcus.
Пример 17.
Профилактика рецидивирования злокачественной опухоли. В январе 2004 года в клинике торакальной хирургии двум больным (мужчина в возрасте 57 лет и женщина в возрасте 55 лет) с диагнозом рака легкого в стадии T4N2M+ были произведены паллиативные операции удаления пораженного легкого. Все больные ранее получали химиотерапевтическое и лучевое лечение. После операции больным с их согласия была проведена процедура мобилизации стволовых клеток перифирической крови (ГМ-КСФ по 5 мкг/кг подкожно трехкратно в течении 3 суток) с последующим выделением стволовых клеток методом цитафереза на аппарате Haemonetic. Выделенные клетки были подвергнуты трансфекции кДНК гена человеческой дорназы-альфа (Дезоксирибонуклеазы I) методом катионных липосом и введены больным внутривенно в количестве 50000000 клеток. Процедура была повторена через 3, 6 и 9 месяцев. К настоящему моменту (срок наблюдения - 14 месяцев, контрольные обследования через каждые 3 месяца) ни у одного из наблюдаемых больных не обнаружено признаков прогрессирования заболевания. В то же время данные ретроспективного контроля свидетельствуют о том, что вероятность развития рецидива к данному сроку и в данной клинической ситуации приближается к 100%. На фиг.5 приведены сведения о содержании внеклеточной ДНК крови больных до начала лечения и в период осуществления лечения по заявляемому способу.
Пример 18. Профилактика рецидивирования малярии
Больная Д. 49 лет, поступила в стационар на 20 день от начала заболевания с жалобами на повышение температуры до 40-41°С, потрясающий озноб в утренние и дневные часы, повторяющегося через 48 часа, длительностью 2,5-3 часа, сменяющийся на жар в течение 4 часов, без потливости, слабость, интенсивную диффузную головную боль, плохой аппетит, прерывистый сон. 2 месяца назад приехала из Индии, где проводила отпуск. При микроскопии крови обнаружены Plasmodium Vivax (3-5 в поле зрения). Больной были прописаны Делагил в курсовой дозе 2,5 г и Примаквин по 0,015 г в день в курсовой дозе 0,2 г. На четвертый день от начала лечения при микроскопии в крови сохранялся Plasmodium Vivax, сохранялись приступы лихорадки и гепатоспленомегалия. С согласия больной ей были осуществлены внутрикожные инъекции ДНК из тимуса теленка, смешанной с неполным адъювантом Фрейнда (50 мг/50 мг). Всего 3 инъекции с интервалом 48 часов. В течение 2-х недель осуществлялось симптоматическое лечение. Через 2 недели был назначен повторный курс Делагила, по завершении которого наблюдалась санация крови от паразита, исчезновение приступов лихорадки и нормализация самочувствия.
Формула изобретения
1. Способ профилактики развития онкологических заболеваний, или инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, развивающихся вследствие мутации генов соматических клеток, характеризующийся тем, что в кровь вводят агент, разрушающий внеклеточную ДНК крови.
2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что введение агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови, осуществляют пожизненно.
3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови, используют фермент ДНКазу.
4. Способ профилактики развития онкологических заболеваний, или инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, развивающихся вследствие мутаций генов соматических клеток, характеризующийся тем, что в кровь вводят агент, связывающий внеклеточную ДНК крови.
5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что в качестве агента, связывающего внеклеточную ДНК крови, используют анти-ДНК антитела.
6. Способ профилактики развития онкологических заболеваний, или инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, развивающихся вследствие мутаций генов соматических клеток, характеризующийся тем, что в кровь вводят фермент, изменяющий химическую структуру внеклеточной ДНК крови.
7. Способ профилактики развития онкологических заболеваний, или инфекций, вызываемых бактериями грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, развивающихся вследствие мутаций генов соматических клеток, характеризующийся тем, что в кровь вводят агент, стимулирующий синтез или активность эндогенной дезоксирибонуклеазы, или агент, стимулирующий синтез антител, связывающих внеклеточную ДНК крови.

Патент № 2308968
A61K38/43, A61P37/00, A61P43/00
Авторы:
Генкин Дмитрий Дмитриевич,
Тец Виктор Вениаминович,
Тец Георгий Викторович
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ВО ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОСТРАНСТВАХ ТКАНЕЙ, И ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЕГО РЕАЛИЗАЦИИ
Реферат:
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения и профилактики широкого круга заболеваний, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов человека, таких как: пролиферативные, например, опухолевые и гиперпластические процессы; заболевания инфекционной природы; заболевания, являющиеся следствием атрофических, дегенеративных и воспалительных изменений в органах и тканях, например, системная красная волчанка. Способ лечения включает энтеральное введение фермента ДНКазы в дозах от 2000 до 500000 ед. Кунца на 1 кг массы тела в сутки. Лекарственный препарат для осуществления способа содержит фермент ДНКазу, содержание которой в единичной дозе составляет от 50000 до 5000000 ед. Кунца. Впервые установлено, что энтеральное введение таких высоких доз ДНКазы обеспечивает абсорбцию каталитически значимых количеств этого фермента в кровь с достоверным увеличением ДНК-гидролитической активности фермента. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 6 табл.

(56) (продолжение):
CLASS="b560m"oral administration // Schweiz Med Wochenschr. 1979 Oct 27; 109(41): 1538-44, реферат, он-лайн, найдено в Интернет на www.pubmed.com, найдено 29.03.2006, PMID: 394315 [PubMed - indexed for MEDLINE].
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения и профилактики широкого круга заболеваний, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов человека. Круг подобных заболеваний широк и включает следующие основные группы заболеваний:
- заболевания пролиферативной природы, сопровождающиеся ускоренным размножением и избыточной гибелью собственных клеток организма, например, опухолевые и гиперпластические процессы; высокое содержание внеклеточной ДНК связано с плохим прогнозом заболевания (Lecomte Т., et al., Detection of free-circulating tumor-associated DNA in plasma of colorectal cancer patients and its association with prognosis. Int J. Cancer 2002 Aug. 10; 100(5):542-8;
- заболевания инфекционной природы, связанные с размножением инфекционного агента, например, бактериальные, вирусные, грибковые, протозойные инфекции, дисбактериозы; внеклеточная ДНК при подобных заболеваниях является либо самостоятельным патогенным фактором, например, в случае инфекций, вызываемых ДНК-содержащими вирусами, либо способствует развитию микроорганизмов, являясь основой внеклеточного матрикса их колоний (Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation, Cynthia В Whitchurch et al., Science. 2002 Feb. 22; 295(5559):1487), участвуя в генетической трансформации микроорганизмов (Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Deitsch K., Driskill С., Wellems Т.: Nucleic Acids Res. 2001 Feb. 1; 29(3):850-3), либо осложняет их течение, формируя основу гнойно-некротических масс (Zaman S., et al. Direct amplification of Entamoeba histolytica DNA from amoebic liver abscess pus using polymerase chain reaction, Parasitol Res. 2000 Sep; 86(9):724-8.); With S.Sherry and L.R.Christensen. Presence and significance of desoxyribose nucleoprotein in the purulent pleural exudates of patients. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1948, 68:179-84;
- заболевания, являющиеся следствием атрофических, дегенеративных и воспалительных изменений в органах и тканях, например, системная красная волчанка; внеклеточная ДНК при этом является одним из ключевых факторов патогенеза заболевания (Pisetsky D.S., Immune response to DNA in systemic lupus erythematosus. Isr Med Assoc J., 2001 Nov.; 3(11):850-3); ДНК, образующееся из гибнущих клеток, может ускорять процессы старения и атрофии тканей человека, US 6524578.
Известны способы лечения ряда из перечисленных заболеваний, путем энтерального применения определенных ферментов; в частности, в патенте СА 2394856 описывают энтеральное введение ферментов, разрушающих поверхностные белки, липиды и углеводороды клеток для лечения инфекционных заболеваний. Этот способ не обеспечивает разрушения дезоксирибонуклеиновых кислот, являющихся одним из основных компонентов как межклеточного матрикса растущих микроорганизмов, так и гнойных детритных масс и, как следствие, данный способ недостаточно эффективен в лечении инфекционных заболеваний.
Известен способ лечения заболеваний, сопровождающихся воспалением, путем орального применения комплекса протеолитических и липолитических ферментов Бромелайн, GB 984464. Применяемые по описанному способу композиции также не содержат ферментов, разрушающих дезоксирибонуклеиновые кислоты. В связи с низкой лечебной эффективностью описанный способ не нашел самостоятельного применения в клинической фармакологии и используется лишь в качестве вспомогательного (Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use, Maurer H.R., Cell Mol Life Sci 2001 Aug 58: pp.1234-45).
Известен способ системной энзимотерапии (СЭТ), основанный на применении композиций протеолитических ферментов, вводимых перорально или в виде клизм в высоких дозах (Wrba, Н. & Pecher, О. Enzymes: A Drug of the Future. Ecomed Verlagsgesellschaft AG & Co., 1993).
Известны также способы лечения заболеваний человека, сопровождающихся воспалением, основанные на энтеральном введении комплекса ферментов, содержащего кроме гликолитических, протеолитических и липолитических ферментов, также и ферменты, разрушающие дезоксирибонуклеиновую кислоту (дезоксирибонуклеазы, ДНКазы), GB 1005985.
В патенте GB 1005985 описан способ лечения воспалительных заболеваний путем орального введения комбинации ферментов, в том числе стептодорназы (стрептококковой ДНКазы) и химических противовоспалительных субстанций; в патенте указано на предпочтительное использование именно протеолитических ферментов, получаемых из поджелудочной железы; также делается вывод об отсутствии влияния дозы используемых ферментов на эффективность лечения.
Среди известных способов лечения, основанных на энтеральном применении ферментов ДНКаз, наиболее близким к заявляемому способу является способ лечения широкого круга заболеваний, сопровождающихся воспалением, основанный на энтеральном введении фермента ДНКазы путем приема таблеток Varidase, содержащих комплекс ферментов стерептокиназы и стрептодорназы (ДНКаз). Способ лечения основан на энтеральном введении от 4 до 8 таблеток Varidase в день для лечения некоторых заболеваний, сопровождающихся воспалением (ROTE LISTE Buch 2004; ISBN 3-87193-286-8, Rote Liste Service GmbH), и получил наибольшее распространение: Continued marketing of a useless drug ('Varidase') in Panama. Lee D., Lancet 1990 Mar, pp.335:667.
Главным недостатком этого способа является его низкая лечебная и профилактическая эффективность как для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, так и для лечения заболеваний других органов, что связано с отсутствием абсорбции фермента в системную циркуляцию. Это отмечается, в частности, в работе: Orally and rectally administered streptokinase. Investigation of its absorption and activity; Oliven A., Gidron E.; Pharmacology, 1981 vol.22: pp.135-8.
Известен лекарственный препарат для орального приема (Varidase), содержащий стрептококковые ферменты стрептокиназу (протеолитический фермент) и стрептодорназу - стрептококковую дезоксирибонуклеазу. Препарат содержит 10000 единиц стрептокиназы и 2500 единиц стрептодорназы в одной таблетке (ROTE LISTE Buch 2004; ISBN 3-87193-286-8, Rote Liste Service GmbH).
Данный препарат принят в качестве прототипа заявленного лекарственного препарата.
Низкая эффективность препарата стала одной из основных причин того, что таблетки Varidase были сняты с производства и отменена их регистрация как лекарственного средства во многих странах мира и, в частности, в США. Одним из основных аргументов являлась их фармакологическая неэффективность (Department of Health and Human Services Food and Drug Administration; Federal Register, Vol.50, N240; Dec.13, 1985).
В основу настоящего изобретения по п.п.1-7 положено решение задачи создания эффективного способа лечения заболеваний человека, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов.
Согласно изобретению (п.п.1-7) эта задача решается за счет того, что в способе лечения заболеваний человека, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов, путем энтерального введения фермента ДНКазы, фермент ДНКазу вводят в дозах от 2000 до 500000 ед. Кунца на 1 кг массы тела в сутки; при этом в способе фермент ДНКаза может быть введен орально; при этом в способе может быть использована лекарственная форма, обеспечивающая освобождение фермента в ротовой полости; при этом в способе может быть использована лекарственная форма, обеспечивающая освобождение фермента в желудке; при этом в способе может быть использована лекарственная форма, обеспечивающая освобождение фермента в тонком кишечнике; при этом в способе может быть использована лекарственная форма, обеспечивающая освобождение фермента в толстом кишечнике; при этом в способе фермент ДНКазы может быть введен ректально.
В основу изобретения по п.п.8-13 положено решение задачи создания лекарственного препарата для реализации заявляемого способа.
Согласно изобретению (п.п.8-13) эта задача решается за счет того, что в лекарственном препарате для лечения заболеваний человека, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов человека, содержащем биологически активное вещество - фермент ДНКазу, содержание фермента ДНКазы в единичной дозе препарата составляет от 50000 до 5000000 ед. Кунца; при этом лекарственный препарат может быть выполнен в виде таблетки для приема через рот; при этом лекарственный препарат может быть выполнен в виде капсулы для приема через рот; при этом лекарственный препарат может быть выполнен в виде суппозитория для ректального введения; при этом лекарственный препарат может быть выполнен в виде жевательной резинки или орально-буккальной пленки, или сублингвальной таблетки; при этом лекарственный препарат может быть выполнен с возможностью дозирования в виде зубной пасты или зубного геля, или порошка, или ополаскивателя полости рта, жевательной резинки, орально-буккальной пленки или сублингвальной таблетки.
Заявителем впервые было установлено, что при энтеральном приеме только высоких доз фермента, превышающих 2000 KU/кг/сутки, наблюдается достоверное увеличение ДНК-гидролитической активности в моче и нарастает содержание в моче иммунореактивного фермента ДНКазы I (таблица 1). Данные изменения имеют в диапазоне доз от 2000 до 500000 KU/кг/сутки доза-зависимый характер. В целом это свидетельствует о том, что при энтеральном приеме высоких доз ДНКазы происходит абсорбция каталитически значимых количеств фермента в кровь. Подобное открытие делает возможным создание эффективных энтеральных лекарственных форм ДНКазы для лечения заболеваний, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов человека, вне пределов пищеварительного тракта.
Благодаря реализации отличительных признаков изобретения достигается важный новый результат: обеспечивается эффективность и безопасность лечения широкого круга заболеваний, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов; кроме того, важным свойством способа является техническая простота реализации изобретения (как способа, так и препарата).
Кроме того, как было установлено заявителями, при осуществлении заявляемого способа для лечения инфекционных заболеваний происходит угнетение формирования биопленок патогенных микрорганизмов, а также подавление возникновения и селекции лекарственно-резистентных клонов микроорганизмов. Данное обстоятельство позволяет использовать заявляемый способ для осуществления контроля за развитием и распространением лекарственной устойчивости среди как нормальной, так и среди патогенной микрофлоры организма человека.
Расчетное количество бычьей панкреатической ДНКазы I активностью 3500 KU/мг (производства Seravac; ЮАР) растворяли в воде и вводили однократно энтерально (per os) 24 здоровым добровольцам (по 3 добровольца на одну дозу). После этого в течение 12 часов осуществляли сбор суммарной мочи; определяли вискозиметрическим методом ДНК-гидролитическую активность мочи, KU на 1 мл суммарной мочи; наличие бычьей сывороточной ДНКазы I в суммарной фракции ДНКазы I определяли по изменению картины электрофореграммы при гель-электрофорезе с изоэлектрофокусированием. Результаты исследования приведены в таблице 1.
Таблица 1
Доза ДНКазы (KU/кг) однократно 0 250 1000 2000 20000 35000 50000 100000 500000
ДНК-гидролитическая активность мочи, KU/мл 0,11 0,13 0,09 0,5 0,9 5,2 10,3 17,0 37,9
Наличие бычьей панкреатической ДНКАзы I в суммарной фракции ДНКазы крови - - - + + + ++ ++ +++
Реализация изобретения по п.п.8-13 иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.
Твердая дозированная форма ДНКазы для переорального приема следующего состава:
Сухая бычья панкреатическая ДНКаза 100000 ед. Кунца
Магния стеарат 2,5 мг
Микрокристаллическая целлюлоза 50 мг
Лактоза до образования таблетки
массой 200 мг
Лекарственную форму готовят следующим образом: сухую бычью панкреатическую ДНКазу активностью 3500 KU/мг (производства Seravac; ЮАР) (из расчета 100000 ед. Кунца (около 28 мг на 1 таблетку) смешивают с магния стеаратом, смачивают, гранулируют. Смешивают с лактозой и микрокристаллической целлюлозой в количестве, необходимом для получения таблеток массой 200 мг, смесь прессуют в таблетки.
Пример 2:
Капсульная дозированная форма ДНКазы для переорального приема следующего состава:
Сухая бычья панкреатическая ДНКаза 1000000 ед. Кунца
Магния стеарат 2,5 мг
Микрокристаллическая целлюлоза 40 мг
Лекарственную форму готовят следующим образом: сухую кристаллическую бычью панкреатическую ДНКазу активностью 3500 KU/мг (производства Seravac; ЮАР) из расчета 1000000 ед. Кунца (около 280 мг на 1 капсулу) смешивали с магния стеаратом и микрокристаллической целлюлозой, увлажняли, прессовали и гранулировали. Гранулят засыпали в целлюлозные капсулы.
Пример 3.
Мягкая дозированная лекарственная форма для ректального применения следующего состава (на 1 свечу весом 3 г).
Бычья панкреатическая ДНКаза 5000000 ед. Кунца
Твердая жировая основа 1600 мг
Пример 4
Дозированная лекарственная форма в виде пластин для орального использования (жевательная резинка).
Бычья панкреатическая ДНКаза 1000000 ед. Кунца
Резиновая основа 2500 мг
Сахар, декстроза, тапиока, воск до 3000 мг
Реализация заявленного способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 5.
Лечение онкологических заболеваний.
В исследование было включено 9 больных, поступивших в клинику хирургии с диагнозом рецидива рака молочной железы. Всем больным ранее выполнялось оперативное и химио-лучевое лечение заболевания. Всем больным при госпитализации установлены противопоказания к дальнейшему оперативному и химио-лучевому лечению. Все больные имели измеряемые метастазы в печени и/или легких. Все больные дали согласие на осуществление лечения. На момент начала исследования ожидаемая продолжительность жизни больных составляла не менее 3 месяцев.
1 группа больных (3 человека) получала капсулы-плацебо в течение трех месяцев.
2 группа больных (3 человека) получала капсулы по примеру 2 в суточной дозе 5000000 ед. Кунца в течение трех месяцев.
3 группа больных (3 человека) получала таблетки Varidase (производства Wyeth) в максимальной рекомендованной дозе 10 таблеток в сутки (25000IU стрептодорназы в сутки) в течение 3 месяцев.
Одна больная группы 3 была госпитализирована через 9 недель после начала лечения в связи с резким ухудшением самочувствия и прогрессированием метастазирования и скончалась в клинике через 3 дня после госпитализации.
Через 3 месяца после начала лечения больные были повторно госпитализированы. Всем больным была проведена контрольная компьютерная томография, осуществлено клиническое и биохимическое исследование крови, произведена оценка общего состояния по шкале Карновского.
У всех больных групп 1 и 3 отмечено увеличение размеров метастатических узлов в печени и легких, появление новых метастатических очагов, выявлено снижение в среднем на 30% индекса Карновского. У трех больных из пяти заметно ухудшились биохимические показатели крови (снижение содержания альбумина в сыворотке, нарастание гепатоцитолитического синдрома, анемии и биохимических признаков воспаления).
У больных группы 2 при повторном томографическом исследовании не выявлено признаков увеличения размеров ранее имевшихся метастатических узлов и не отмечено появления новых. В одном случае отмечено увеличение индекса Карновского на 40%. У двух других больных индекс Карновского не изменился. Отмечено повышение содержания сывороточного альбумина и гемоглобина крови у всех трех больных.
Пример 6.
Лечение инфекционного мононуклеоза, вызываемого ДНК-содержащим вирусом EBV.
В исследование было включено 20 больных в возрасте от 15 до 28 лет с иммунологически подтвержденным диагнозом инфекционного мононуклеоза. Больные были разбиты на 3 группы:
1 группа больных (8 человек) получала таблетки-плацебо в течение 5 суток и стандартную симптоматическую терапию (глюкокортикоиды и антибиотики).
2 группа больных (6 человек) получала таблетки по примеру 1 в суточной дозе 25000 ед. Кунца на кг массы тела в течение 5 суток.
3 группа больных (3 человека) получала таблетки Varidase (производства Wyeth) в максимальной рекомендованной дозе 10 таблеток в сутки (25000IU стрептодорназы в сутки) в течение 5 суток.
Результаты лечения приведены в таблице 2.
Таблица 2
Синдром Сроки исчезновение синдрома после начала заболевания (сут)
1 группа 2 группа 3 группа
Лихорадка 12 7 11
Периферическая лимфоаденопатия 16 9 17
Тонзилит 15 11 14
Гепатоспленомегалия 17 12 18
Пример 7.
Лечение флегмон челюстно-лицевой области
В исследование было включено 15 больных в состоянии средней тяжести, поступивших в клинику челюстно-лицевой хирургии с диагнозом флегмона челюстно-лицевой области. Больные были разделены на 3 группы:
1 группа больных (5 человек) получала таблетки-плацебо в течение трех суток и стандартную антибактериальную терапию в течение пяти суток (цефотаксим 3 г в сутки внутримышечно).
2 группа больных (5 человек) получала таблетки по примеру 1 в суточной дозе 1500000 ед. Кунца (15 таблеток) в течение 3 суток и стандартную антибактериальную терапию в течение 5 суток (цефотаксим 3 г в сутки внутримышечно).
3 группа больных (5 человек) получала таблетки Varidase (производства Wyeth) в максимальной рекомендованной дозе 10 таблеток в сутки (25000IU стрептодорназы в сутки) в течение 3 суток и стандартную антибактериальную терапию в течение 5 суток (цефотаксим 3 г в сутки внутримышечно).
Результаты лечения приведены в таблице 3
Таблица 3
Группа 1 Группа 2 Группа 3
Сроки прекращения лихорадки после начала лечения 5 день 2 день 5 день
Сроки очищения раны после начала лечения 7 день 3 день 6 день
Сроки закрытия раны после начала лечения 12 день 7 день 11 день
Наличие резистентных к применяемому антибиотику микроорганизмов 2 из 5 0 1 из 5
Пример 8.
Лечение пародонтита.
В исследование было включено 30 пациентов со средне-тяжелой степенью пародонтита. В начале исследования всем пациентам удаляли зубные отложения и обучали стандартному методу чистки с использованием зубных нитей и межзубных ершиков. Пациенты были разбиты на 3 группы:
1 группа - 10 пациентов в дальнейшем использовали только зубную пасту Колгейт;
2 группа - 10 пациентов в дальнейшем использовали зубную пасту Колгейт и применяли жевательную резинку с ДНКазой по примеру 4 (по 1/4 пластины жевалось в течение 30 минут 4 раза в сутки) в течение 4 недель.
3 группа - 10 пациентов в дальнейшем использовали зубную пасту Колгейт и применяли таблетки Varidase Buccal Tablets в течение 4 недель;
Определяли показатели индекса Силенса и Лоэ (индекс гигиены полости рта) и индекса Мюллермана (индекс кровоточивости десневой бороздки) до начала исследования и его окончании.
Результаты исследования приведены в таблице 4.
Таблица 4
Группы Индексы До лечения После лечения
1 Группа Силенс и Лоэ 1,77±0,27 1,31±0,35
Мюллермана 1,4±0,55 0,65±0,31
2 Группа Силенс и Лоэ 1,78±0,37 0,71±0,38
Мюллермана 1,35±0,б7 0,29±0,21
3 Группа Силенс и Лоэ 1,74±0,35 1,23±0,45
Мюллермана 1,48±0,41 0,8±0,32
Пример 9.
Лечение системной красной волчанки.
В исследование было включено 16 пациентов с установленным диагнозом системной красной волчанки и лабораторными симптомами гломерулонефрита (протеинурия, микрогематурия). Все пациенты получали стандартную терапию (нестероидные противовоспалительные средства, хлороквин). Пациенты опытной группы (8 человек) получали дополнительно свечи по примеру 3 в дозе 250000 ед. Кунца на кг массы тела в сутки на протяжении 15 суток. Изучали концентрацию ДНК в плазме крови до начала лечения и после его окончания. Содержание ДНК в плазме у контрольных больных достоверно не изменилось. У больных опытной группы выявлено двукратное снижение ДНК в плазме крови по окончании 15-дневного курса лечения.
Пример 10.
Лечение возрастного нарушения подвижности сперматозоидов.
В исследование были включены 18 здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 50 до 55 лет. Пациенты были разделены на 3 группы:
1 группа пациентов (7 человек) получала капсулы-плацебо в течение 30 суток;
2 группа пациентов (6 человек) получала капсулы по примеру 2 в суточной дозе 35000 ед. Кунца на кг массы тела в течение 30 суток;
3 группа пациентов (5 человек) получала таблетки Varidase (производства Wyeth) в максимальной рекомендованной дозе 10 таблеток в сутки (25000IU стрептодорназы в сутки) в течение 5 суток.
Исследовали подвижность сперматозоидов в образцах спермы у пациентов в трех группах до начала лечения и по его завершении. До начала лечения процентное содержание подвижных сперматозоидов в образцах спермы у пациентов всех трех групп находилось в пределах 46-54%. Показатели содержания подвижных сперматозоидов у пациентов групп 1 и 3 после лечения не изменились. Содержание подвижных сперматозоидов в образцах спермы пациентов 2-й группы после лечения составило 58-62%.
Пример 11
Влияние заявляемого способа на число выявляемых у больных бактерий-мутантов, устойчивых к рифампицину. Осуществляли посев микрофлоры носоглотки у больного, получавшего лечение рифампицином (1), и больного, получавшего лечение рифампицином парралельно с лечением по заявляемому способу (2). Посевы высевали на агаризованную среду, содержащую рифампицин 50 мкг/мл. Число КОЕ оценивали серийными разведениями с высевами на агаризованную среду без антибиотика (см. табл.5).
Таблица 5
Больной Число КОЕ Число клонов, устойчивых к рифампицину
1 (3,7±0,6)×109 110
2 (2,0±0,1)×108 2-3
Из таблицы 5 видно, что у больного, получавшего антибиотик совместно с лечением по заявляемому способу, высевалось на порядок меньшее число микрорганизмов и среди них всего несколько рифампицин-устойчивых клонов.
Пример 12
Влияние заявляемого способа на число высеваемых у больных мутантов, устойчивых к гентамицину.
Осуществляли посев кала больных, получивших курс лечения гентамицином по поводу острой кишечной инфекции. Посев осуществляли на следующий день после окончания курса лечения. Смешанные культуры выращивали в пробирках как планктонный рост в течение 24 часов. Количество жизнеспособных клеток оценивали по числу КОЕ (колониеобразующих единиц) после 24 часов роста высевами на агаризованную среду, содержащую антибиотик (Км, 50 мкг/мл). В таблице 6 представлены усредненные результаты для группы контрольных больных (Группа А; 3 человека) и группы больных, получавших параллельное лечение по заявляемому способу (Группа Б; 3 человека) (см. табл.6).
Таблица 6
Число КОЕГруппа А 1,8×1010
Группа Б 2,8×109
Из таблицы 6 видно, что у больных, получавшего антибиотик совместно с лечением по заявляемому способу, высевалось на порядок меньшее число микрорганизмов, устойчивых к гентамицину.
Формула изобретения
1. Способ лечения заболеваний человека, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов, путем энтерального введения фермента ДНКазы, отличающийся тем, что фермент ДНКазу вводят в дозах от 2000 до 500000 ед. Кунца на 1 кг массы тела в сутки.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент ДНКазу вводят орально.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют лекарственную форму, обеспечивающую освобождение фермента в ротовой полости.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют лекарственную форму, обеспечивающую освобождение фермента в желудке.
5. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют лекарственную форму, обеспечивающую освобождение фермента в тонком кишечнике.
6. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют лекарственную форму, обеспечивающую освобождение фермента в толстом кишечнике.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент ДНКазу вводят ректально.
8. Лекарственный препарат для лечения заболеваний человека, сопровождающихся повышенным содержанием дезоксирибонуклеиновой кислоты во внеклеточных пространствах тканей и органов человека, содержащий биологически активное вещество - фермент ДНКазу, отличающийся тем, что содержание фермента ДНКазы в единичной дозе препарата составляет от 50000 до 5000000 ед. Кунца.
9. Лекарственный препарат по п.8, отличающийся тем, что выполнен в виде таблетки для приема через рот.
10. Лекарственный препарат по п.8, отличающийся тем, что выполнен в виде капсулы для приема через рот.
11. Лекарственный препарат по п.8, отличающийся тем, что выполнен в виде суппозитория для ректального введения.
12. Лекарственный препарат по п.8, отличающийся тем, что выполнен в виде жевательной резинки или орально-буккальной пленки, или сублингвальной таблетки.
13. Лекарственный препарат по п.8, отличающийся тем, что выполнен с возможностью дозирования в виде зубной пасты или зубного геля, или порошка, или ополаскивателя полости рта, жевательной резинки, орально-буккальной пленки или сублингвальной таблетки.

Способ предотвращения развития рака

Классификация по МПК: A61K
Патентная информация
Патент на изобретение №: 2099080
Автор: Финько Дмитрий Иванович,Голованова Елена Дмитриевна,Голованов Иван Иванович
Дата публикации: 20 Декабря, 1997
Начало действия патента: 1 Января, 1970
Изобретение относится к области биологии, в частности к разделу медицины -онкологии. Предлагаемый способ направлен на предотвращение возникновения рака путем медикаментозного воздействия, назначения специальной диеты и других мер воздействия с целью поддержания в эритроцитах крови человека и животных нормальных соотношений активности нуклеаз и их ингибиторов, имеющих место у здоровых людей, не допуская резкого падения активности нуклеаз.
Изобретение относится к области биологии, в частности к разделу медицины онкологии. Различные способы и методы предотвращения и лечения рака исчисляются в мире, как ни для одной другой болезни, многими и многими тысячами. Большинство из них направлены на излечение или помощь при злокачественных заболеваниях локальных тканей или органов, отдельных участков тела, ограничение распространения рака, некроза клеток опухоли, рассасывание опухоли и т.д. и т.п. К сожалению, эффективность всех существующих методов и способ профилактики лечения рака еще явно недостаточна, что объясняется, главным образом, тем, что до настоящего времени не ...

Способ лечения генерализованных инфекций, вызываемых бактериями, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, обусловленных мутациями генов соматических клеток
Классификация по МПК: A61K A61P
Патент на изобретение №: 2269358
Автор: Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU), Тец Виктор Вениаминович (RU), Тец Георгий Викторович (RU)
Патентообладатель: Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU), Тец Виктор Вениаминович (RU)
Дата публикации: 27 Сентября, 2005
Начало действия патента: 12 Марта, 2004
Адрес для переписки: 191040, Санкт-Петербург, а/я 40, пат.пов. О.Л.Сандигурскому

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения заболеваний, сопровождающихся изменениями внеклеточной ДНК крови, а именно: генерализованных инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, а также заболеваний, обусловленных мутациями генов соматических клеток. Для этого в кровь вводят агент, разрушающий внеклеточную ДНК крови. В качестве такого агента используют ДНКазу, в частности, в дозах, обеспечивающих изменение электрофоретического профиля внеклеточной ДНК крови, выявляемое пульс-гельэлектрофорезом. ДНКазу можно вводить в дозах и режимах, обеспечивающих превышение уровня ДНК-гидролитической активности плазмы крови, 150 единиц Кунца на литр плазмы, на протяжении суммарно более 12 часов в сутки. Способ обеспечивает эффективное лечение указанных заболеваний при отсутствии побочных эффектов.

http://bankpatentov.ru/node/433105
Способ замедления наступления болезненных состояний, связанных с увеличением возраста человека
Классификация по МПК: A61K A61P
Патент на изобретение №: 2269357
Автор: Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU), Тец Виктор Вениаминович (RU), Тец Георгий Викторович (RU)
Патентообладатель: Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU), Тец Виктор Вениаминович (RU)
Дата публикации: 27 Сентября, 2005
Начало действия патента: 12 Марта, 2004
Адрес для переписки: 191040, Санкт-Петербург, а/я 40, пат.пов. О.Л.Сандигурскому

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для увеличения продолжительности жизни за счет замедления наступления болезненных состояний, связанных с увеличением возраста. Для этого в циркуляцию крови вводят агент, инактивирующий внеклеточную ДНК крови. В качестве такого агента могут быть использованы ДНКаза, анти-ДНК антитела, ферменты, изменяющие химическую структуру внеклеточной ДНК крови, а также агенты, стимулирующие синтез или активность эндогенной ДНКазы или стимулирующие синтез антител, связывающих внеклеточную ДНК крови. Способ обеспечивает эффект лечения при отсутствии прямого воздействия на генетический аппарат стареющих клеток.

http://bankpatentov.ru/node/433104
Способ лечения онкологических заболеваний
Классификация по МПК: A61K A61P

Патентная информация
Патент на изобретение №:
2269356
Автор:
Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU), Тец Виктор Вениаминович (RU), Тец Георгий Викторович (RU)
Патентообладатель:
Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU), Тец Виктор Вениаминович (RU)
Дата публикации:
27 Сентября, 2005
Начало действия патента:
12 Марта, 2004
Адрес для переписки:
191040, Санкт-Петербург, а/я 40, пат.пов. О.Л.Сандигурскому
Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения злокачественных опухолей. Для этого обеспечивают введение в кровь агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови. Этот агент вводят в дозах, обеспечивающих изменение электрофоретического профиля внеклеточной ДНК крови. Агент также можно вводить в дозах и режимах, обеспечивающих уровень ДНК-гидролитической активности плазмы крови, измеряемый в плазме крови и превышающий 150 единиц Кунца на литр плазмы, на протяжении суммарно более 12 часов в сутки. Лечение может осуществляться непрерывно не менее 2 суток. В качестве агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови, может быть использован ДНКаза, в частности, бычья панкреатическая ДНКаза или рекомбинантная человеческая ДНКаза. Способ предполагает также введение агента, связывающего внеклеточную ДНК крови, например, анти-ДНК антитела. Способ обеспечивает малотоксичное и эффективное лечение опухолей, в частности, при длительной, даже пожизненной терапии указанными средствами.

http://bankpatentov.ru/node/429183
Способ лечения заболеваний, сопровождающихся изменениями качественного и/или количественного состава внеклеточной днк крови (варианты)
Классификация по МПК: A61K
Патент на изобретение №: 2267329
Автор: Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU), Тец Виктор Вениаминович (RU), Тец Георгий Викторович (RU)
Патентообладатель: Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU), Тец Виктор Вениаминович (RU)
Дата публикации: 10 Января, 2006
Начало действия патента: 12 Марта, 2004
Адрес для переписки: 191040, Санкт-Петербург, а/я 40, пат.пов. О.Л.Сандигурскому

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения злокачественных опухолей, или инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, развивающихся вследствие мутаций генов соматических клеток. Для этого согласно вариантам данного способа в кровь вводят агент, связывающий внеклеточную ДНК крови, или вводят фермент, изменяющий химическую структуру внеклеточной ДНК крови, или в кровь вводят агент, стимулирующий синтез или активность эндогенной дезоксирибонуклеазы, или агент, стимулирующий синтез антител, связывающих внеклеточную ДНК крови. Способ позволяет получить высокую эффективность малотоксичного этиологического лечения указанных заболеваний.

http://www.freepatent.ru/patents/2269356
Способ лечения онкологических заболеваний
(РФ № 2269356)
Классы МПК: A61K38/43 энзимы; проэнзимы; их производные
A61K38/44 оксидоредуктазы (1)
A61K38/46 гидролазы (3)
A61P35/00 Противоопухолевые средства
Автор(ы): Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU), Тец Виктор Вениаминович (RU), Тец Георгий Викторович (RU)
Патентообладатель(и): Генкин Дмитрий Дмитриевич (RU),
Тец Виктор Вениаминович (RU)
Приоритеты: подача заявки: 2004-03-12
публикация патента: 10.02.2006
Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения злокачественных опухолей. Для этого обеспечивают введение в кровь агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови. Этот агент вводят в дозах, обеспечивающих изменение электрофоретического профиля внеклеточной ДНК крови. Агент также можно вводить в дозах и режимах, обеспечивающих уровень ДНК-гидролитической активности плазмы крови, измеряемый в плазме крови и превышающий 150 единиц Кунца на литр плазмы, на протяжении суммарно более 12 часов в сутки. Лечение может осуществляться непрерывно не менее 2 суток. В качестве агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови, может быть использован ДНКаза, в частности, бычья панкреатическая ДНКаза или рекомбинантная человеческая ДНКаза. Способ предполагает также введение агента, связывающего внеклеточную ДНК крови, например, анти-ДНК антитела. Способ обеспечивает малотоксичное и эффективное лечение опухолей, в частности, при длительной, даже пожизненной терапии указанными средствами. 10 з.п. ф-лы, 6 табл.

CLASS="b560m"carcinoma. Ann. N.Y. Acad. Sci., 2001 Sep: 945: 59-67. GORRINI G. et al. Effect of apoptogenic stimuli on colon carcinoma cell lenes with a different c-myc expression level. Int. J. Mol. Med 2003 Jun; 11(6): 737-42.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения преимущественно солидных опухолей.

Популяции опухолевых клеток, развивающиеся в организме больного, обладают чрезвычайно высокой степенью генетической изменчивости, намного превышающей таковую у здоровых клеток. Генетическая изменчивость популяций раковых клеток позволяет им в процессе заболевания генерировать фенотипы, нечувствительные к иммунному и морфогенетическому контролю, способные к инвазии и метастазированию и нечувствительные к противоопухолевой терапии. Считается, что селекционный отбор и клональная экспансия раковых клеток лежат в основе биологической и клинической "прогрессии" опухолей. В соответствии с этими представлениями стратегия современной противоопухолевой терапии основана на принципе уничтожения клонов опухолевых клеток в организме больного с помощью методов - химиотерапии, радиотерапии, иммунотерапии, биотерапии, хирургического удаления и различных их комбинаций.

Из нехирургических методов лечения онкологических заболеваний наибольшее распространение получили способы химиотерапии, радиотерапии, биотерапии, а в последнее время и иммунотерапии, направленные на уничтожение, повреждение или инактивацию внутриклеточной ДНК опухолевой клетки.

Известны химиотерапевтические методы лечения при помощи препаратов платины, см. "Molecular mechanisms involved in cisplatin cytotoxicity". Jordan P, Carmo-Fonseca M, Cell Mol Life Sci 2000 Aug. v 57: pp.1229-35, антрациклиновых антибиотиков, см. "Daunorubicin and doxorubicin, anthracycline antibiotics, a physicochemical and biological review", Aubel-Sadron G, Londos-Gagliardi D, Biochimie 1984 May v.66: pp.333-52, алкилирующих агентов, см. "An overview of cyclophosphamide and ifosfamide pharmacology". Fleming RA, Pharmacotherapy 1997 Sep-Oct v.17: pp.146S-154S, и производных подофилотоксинов, см. "Podophyllotoxins: current status and recent developments", Damayanthi Y, Lown JW, Curr Med Chem 1998 Jun 5: v 3 205-52.

Получают распространение радиоиммунотералевтические методы, позволяющие облучать ядра опухолевых клеток, содержащие внутриклеточную ДНК, альфа-частицами из альфа-эмиттеров, специально доставляемых внутрь раковых клеток для повышения эффективности воздействия на внутриклеточную ДНК, см. "Targeted alpha therapy: evidence for potential efficacy of alpha-immunoconjugates in the management of micrometastatic cancer" Alien BJ, Australas Radiol 1999 Nov v.43: pp 480-6.

Известны биотерапевтические и иммунотерапевтические методы, направленные на индукцию апоптоза опухолевых клеток - процесса гибели раковой клетки, запускаемого активацией внутриклеточных нуклеаз и последующим разрушением внутриклеточной ДНК опухолевой клетки, например, путем введения больному генотерапевтических конструкций, содержащих гены, запускающие процесс апоптоза, см. "Phase I trial of adenovirus-mediated p53 gene therapy for recurrent glioma: biological and clinical results" Lang FF, Bruner JM, Fuller ON, Aldape K, Prados MD, Chang S, Berger MS, McDermott MW, Kunwar SM, Junck LR, Chandler W, Zwiebel JA, Kaplan RS, Yung WK, J Clin Oncol 2003 Jul 1 21:13 2508-18, или гены, кодирующие факторы, активирующие внутриклеточные индуцирующие апоптоз нуклеазы, см. "Adenovirus-mediated transfer of caspase-8 augments cell death in gliomas: implication for gene therapy." Shinoura N, Koike H, Furitu T, Hashimoto M, Asai A, Kirino T, Hamada H, Hum Gene Ther 2000 May 20 11:8 1123-37, или путем введения противоопухолевых вакцин, см. "Vaccine-induced apoptosis: a novel clinical trial end point?" Amin S, Robins RA, Maxwell-Armstrong CA, Scholefield JH, Durrant LG, Cancer Res 2000 Jun 60: 3132-6.

В патенте US 6455250 описано использование эндонуклеазы Endo-SR для лечения раковых заболеваний путем ее внутриклеточной доставки в клетку-мишень.

Среди перечисленных способов метод химиотерапевтического лечения опухолей с помощью Этопозида-4'-Деметилпиподофиллотоксин 9-[4,6-O-R)-этилиден]-b-D-гликопиранозида избран нами в качестве прототипа. Топоизомераза II является необходимым клеточным ферментом, регулирующим многие аспекты функционирования внутриклеточной ДНК. Фермент осуществляет интерконверсию различных топологических форм внутриклеточной ДНК, генерируя при этом транзиторные разрывы двухцепочечной ДНК. Этопозид, являясь ингибитором Топоизомеразы II, увеличивает внутриклеточную концентрацию комплексов Топоизомераза II - разрезанная ДНК. В результате воздействия препарата происходит накопление большого количества двухнитевых разрывов внутриклеточной ДНК, что и является причиной гибели клетки, см. "Topoisomerase II as a target for anticancer drugs: when enzymes stop being nice". Fortune JM, Osheroff N., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 2000, v.64: pp.221-53.

Недостатком способа-прототипа, как и других известных способов, является низкая эффективность. Это объясняется следующим. Способ-прототип, как и другие известные способы, имеет мишенью терапевтического воздействия опухолевую клетку, в первую очередь ее внутриклеточную ДНК. Опыт подобной терапии свидетельствует, что:

- вследствие высокой генетической изменчивости опухолевые клетки, как правило, приобретают нечувствительность к применяемой терапии до того, как используемая методика позволяет их в необходимой степени уничтожить;

- внутриклеточная ДНК является относительно труднодоступной мишенью, что влечет за собой необходимость применения высоких доз противоопухолевых препаратов и/или сложных систем их доставки (Drug Delivery Systems).

Кроме того, следует отметить, что способ-прототип, предусматривающий воздействие на внутриклеточную ДНК опухолевых клеток, влечет за собой неизбежное разрушение ДНК здоровых клеток, что обуславливает его высокую токсичность.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи создания высокоэффективного и малотоксичного способа лечения онкологических заболеваний.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что вводят в кровь агент, разрушающий внеклеточную ДНК крови; этот агент может вводиться в дозах, обеспечивающих изменение электрофоретического профиля внеклеточной ДНК крови, выявляемое пульс-гельэлектрофорезом; этот агент может вводиться в дозах и режимах, обеспечивающих уровень ДНК-гидролитической активности плазмы крови, измеряемый в плазме крови и превышающий 150 единиц Кунца на литр плазмы, на протяжении суммарно более 12 часов в сутки; лечение может осуществляться непрерывно не менее 2 суток; в качестве агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови, может быть использован фермент ДНКазы, в частности, бычья панкреатическая ДНКаза, которую вводят парэнтерально в дозах от 50000 единиц Кунца до 250000000 единиц Кунца в сутки ежедневно на протяжении 5-360 дней, или рекомбинантная человеческая ДНКаза, при этом может быть использована рекомбинантная человеческая ДНКаза I (дорназу-альфа), которую вводят парэнтерально в дозах 0,15-500 мг/кг массы тела в сутки ежедневно на протяжении 5-360 дней; лечение может проводиться пожизненно; дополнительно в кровь может вводиться агент, связывающий внеклеточную ДНК крови; в качестве этого агента могут быть использованы анти-ДНК антитела.

Факт циркуляции внеклеточной ДНК в крови больных онкологическими заболеваниями описан в ряде работ (P.Anker et al., Clinica Chimica Acta, v.313, 2001, pp.143-146; Fedorov N.A. et.al., Bull.Exp.Biol.Med., v 102, 1986, pp.281-283). В патенте US 5952170 описано определение внеклеточной ДНК в крови для диагностики и прогнозирования течения онкологических заболеваний. В патентах US 6465177 и US 6156504 описывают использование внеклеточной ДНК крови для определения мутаций в онкогенах и микросателлитных участках генов, изучения геномной нестабильности в опухолях и использования результатов наблюдений для диагностики, мониторирования и прогнозирования течения заболевания.

Тем не менее, до настоящего времени отсутствовал систематический анализ спектра внеклеточной ДНК крови и ее биологической роли. Данные исследований внеклеточной ДНК крови без проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в печати не обнаружены. ПЦР может сильно искажать состав внеклеточной ДНК крови в силу специфичности праймеров, применяемых для амплификации. До последнего времени проводился, в основном, генетический анализ ДНК плазмы, произведенный при помощи ПЦР или блот-гибридизации, и направленный на изучение изменений в определенных участках генома (например, в микростателлитах и отдельных генах) при опухолевом процессе (Sanchez-Cespedes M., et al., Ann Oncol, 1998, v 9(1), pp.113-116; Sozzi G., et al., Clin Can Res, 1999, v 5(10), pp.2689-2692; Chen X.Q., et al., Nat Med, 1996, v 2(9), pp.1033-1035).

Таким образом, в известных заявителю источниках отсутствуют знания о генетическом репертуаре внеклеточной ДНК крови больных при онкопатологии, биологической роли внеклеточной ДНК крови при онкопатологии и возможном терапевтическом эффекте ее уничтожения или инактивации для лечения этих заболеваний.

Заявителем было установлено, что внеклеточная ДНК крови онкологических больных содержит уникальный по своему качественному и количественному составу репертуар генов и регуляторных генетических элементов, резко отличающийся от репертуара ДНК, описанного в геноме человека. В отличие от внутриклеточной ДНК, внеклеточная ДНК крови онкологических больных содержит, в основном, уникальные гены человека, включая гены, вовлеченные в поддержание и формирование злокачественного поведения раковых клеток.

Показано, что внеклеточная ДНК крови при онкологической патологии способствует злокачественному росту.

Разрушение, в том числе вместе с модификацией и связыванием, внеклеточной ДНК крови при онкопатологии препятствует злокачественному росту. Подобное вмешательство имеет как самостоятельную терапевтическую ценность, так и повышает эффективность традиционных методов терапии.

Указанные выше новые свойства заявленного изобретения, базирующиеся на принципиально новых представлениях о механизме онкологических заболеваний, позволяют сделать вывод о соответствии заявленного способа критерию "изобретательский уровень".

Заявленный способ реализуется следующим образом.

Материалы и методы.

Использовали следующие агенты, разрушающие внеклеточную ДНК крови: бычью панкреатическую ДНКазу (Sigma и Самсон-Мед), рекомбинантную человеческую ДНКазу I (Дорназу альфа; Genetech), внеклеточную нуклеазу Serratia Mercenses. Раствор ДНКазы для введения готовился растворением матричного раствора ДНКазы в стерильном фосфатном буфере непосредственно перед введением.

ДНК плазмы крови выделяли следующим образом: свежую (не более 3-4 часов после забора) плазму крови с добавленным антикоагулянтом (цитрат натрия) центрифугировали на подушке из Ficoll-PlaquePlus (Amersham-Phannacia) при 1500g 20 минут при комнатной температуре. Плазму (1/2 от всего количества) аккуратно отбирали, не задевая остаток клеток на подушке фиколла, и откручивали при 10000g 30 минут, чтобы избавиться от обломков клеток и дебриса. Супернатант отбирали, не затрагивая осадок, добавляли до 1% саркозила, до 50 мМ трис-HCl, рН 7,6, до 20 мМ ЭДТА, до 400 мМ NaCl, и равный объем смеси фенол-хлороформ 1:1. Полученную эмульсию инкубировали при 65°С 2 часа, затем отделяли фенол-хлороформ центрифугированием при 5000g в течение 20 минут при комнатной температуре. Процедуру депротеинизации фенол-хлороформом повторяли идентичным способом трижды, после чего водную фазу обрабатывали хлороформом, затем диэтиловым эфиром. Отделение от органических растворителей производили центрифугированием при 5000g в течение 15 минут. К полученной водной фазе добавляли равный объем изопропанола и инкубировали в течение ночи при 0°С. После осаждения нуклеиновые кислоты отделяли центрифугированием при 0°С, 10000g в течение 30 минут. Осадок нуклеиновых кислот растворяли в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 7,6, 5 мМ ЭДТА, и наносили на подушку из ступенчатого хлористого цезия (1 М, 2.5 М, 5.7 М) в центрифужной пробирке для ротора SW60Ti. Объем ДНК составлял 2 мл, объем каждой ступеньки CsCL - по 1 мл. Ультрацентрифугирование проводили в приборе L80-80 (Beckman) 3 часа при 250000g. ДНК отбирали с поверхности ступеньки 5.7 М по фракциям. Фракции диализировали 12 часов при 4°С. Наличие ДНК во фракциях определяли агарозным электрофорезом, с визуализацией ДНК бромистым этидием. Количество ДНК определяли спектрофотометрически (Beckman DU70) в кювете объемом 100 мкл, снимая спектр от 220 до 320 нм.

В экспериментах использовались штаммы мышиной карциномы легких Люиса и карциномы Эрлиха. Клетки росли в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллин-стрептомицина в среде с 5% углекислого газа.

Для индукции опухолей у мышей клетки выращивали до монослоя, отделяли с помощью раствора трипсин-ЭДТА. Клетки трижды отмывали центрифугированием в фосфатном буфере и ресуспендировали до 0,5·107 в миллилитре. Жизнеспособность определяли по включению метиленового синего в гемоцитометре. Для введения животным использовались суспензии с не менее 95% жизнеспособных клеток.

Использовались мыши линии С57В1 и белые беспородные мыши, полученные из питомника "Рапполово". Вес животных 24-26 грамм. Животные содержались по 6-7 штук в клетке на стандартной диете без ограничения воды. LLC клетки в дозе 5·105 в 100 мкл фосфатного буфера вводились в мягкие ткани бедра. Опухоль Эрлиха перевивалась под кожу правого бока введением 0,2 мл 10%-ной взвеси опухолевых клеток в изотоническом растворе хлорида натрия

В некоторых экспериментах исследовалось содержание внеклеточной ДНК в плазме крови. ДНК выделялась по ранее описанному протоколу. Содержание ДНК измерялось с помощью наборов Pico Green. Электрофорез внеклеточной ДНК крови проводили в 1% агарозном геле. ДНК окрашивали этидиум-бромидом. Сравнительное содержание высокомолекулярной (более 300 пар оснований) фракции ДНК в форезах оценивали денситометрически. В качестве маркера использовали фаг лямбда, обработанный рестриктазами EcoR и Hind III.

Пример 1. Торможение развития опухоли Эрлиха.

Использовали рекомбинантную человеческую ДНКазу I (Genetech).

1 группа - 10 мышей с привитой карциномой Эрлиха - контроль. Мыши получали два раза в день ежедневно с 3 по 7 день после перевивки опухоли внутрибрюшинно инъекции 200 мкл фосфатного буфера.

2 группа - 10 мышей с привитой карциномой Эрлиха, получавших ДНКазу четыре раза в день ежедневно с 3 по 7 день после перевивки опухоли в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно в 200 мкл фосфатного буфера.

3 группа - 10 мышей с привитой карциномой Эрлиха, получавших ДНКазу четыре раза в день ежедневно с 3 по 7 день после перевивки опухоли в дозе 0,5 мг/кг внутрибрюшинно в 200 мкл фосфатного буфера.

4 группа - 10 мышей с привитой карциномой Эрлиха, получавших ДНКазу четыре раза в день ежедневно с 3 по 7 день после перевивки опухоли в дозе 0,1 мг/кг внутрибрюшинно в 200 мкл фосфатного буфера.

5 группа - 10 мышей с привитой карциномой Эрлиха, получавших ДНКазу четыре раза в день ежедневно с 3 по 7 день после перевивки опухоли в дозе 0,05 мг/кг внутрибрюшинно в 200 мкл фосфатного буфера.

Результаты экспериментов оценивали по торможению роста опухоли (ТРО, выраженное в процентах) в последний день введения ДНКазы. ТРО определяли по общепринятой методике. Определяли содержание внеклеточной ДНК крови и ее электрофоретическое фракционирование.

Результаты приведены в таблице 1: размер опухоли, содержание внеклеточной ДНК и ее электрофоретический профиль через 7 дней после перевивки опухоли.

Таблица 1
Группа Объем опухоли Торможение в % Содержание внеклеточной ДНК (нг/мл) Наличие высокомолекулярных фракций во внеклеточной ДНК
Контроль 98+/-14 - 104,8 100%
1 мгкг 23+/-6 76% 38,3 0
0,5 мгкг 32+/-6 67% 55,1 25%
0,1 мгкг 58+/-12 37% 78,0 70%
0,05 мгкг 87+/-11 10% 98,7 100%
Приведенные данные свидетельствуют, что для достижения наилучшего лечебного эффекта необходимо применение достаточно высоких доз препарата ДНКазы I.

Пример 2. Торможение развития опухоли Эрлиха.

Использовали рекомбинантную человеческую ДНКазу I (Genetech).

В эксперименте участвовало 5 групп мышей, привитых LLC.

1 группа - 7 мышей - контроль.

2 группа - 6 мышей, получавших внутрибрюшинно терапию ДНКазой в дозе 1 мг/кг 2 раза в сутки с 3 по 5 день после перевивки.

3 группа - 6 мышей, получавших внутрибрюшинно терапию ДНКазой в дозе 1 мг/кг 2 раза в сутки с 3 по 10 день после перевивки.

4 группа - 6 мышей, получавших терапию ДНКазой в дозе 1 мг/кг 2 раза в сутки с 3 по 15 день после перевивки.

5 группа - 6 мышей, получавших терапию ДНКазой в дозе 1 мг/кг 2 раза в сутки с 3 по 18 день после перевивки.

6 группа - 6 мышей, получавших терапию ДНКазой в дозе 1 мг/кг 2 раза в сутки на 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 и 17 день после перевивки.

7 группа - 6 мышей, получавших внутрибрюшинно терапию ДНКазой в дозе 0,5 мг/кг 4 раза в сутки с 3 по 10 день после перевивки.

Результаты эксперимента оценивали по выживаемости животных на 30 и 50 день после перевивки опухоли - таблица 2

Таблица 2.
Группа 30 день(число живых/павших животных в группе) 50 день(число живых/павших животных в группе)
1 0-7 0-7
2 0-6 0-6
3 3-3 0-6
4 5-1 3-3
5 6-0 6-0
6 0-6 0-6
7 4-2 1-5
Приведенные данные свидетельствуют, что эффективность проводимого лечения увеличивается по мере увеличения длительности лечения. Эффективность лечения падает, если оно не является непрерывным. Многократное введение в течение суток является предпочтительным.

Пример 3. Лечение карциномы легких.

Больной мужчина, 54 лет поступил в клинику с диагнозом карцинома легких.

С согласия больного, с учетом исчерпания всех возможных методов лечения, ему были назначены ежедневные подкожные инъекции препарата дорназы альфа. Лечение начали с введения суточной дозы 50 мкг/кг. Каждый последующий день осуществляли измерение содержания внеклеточной ДНК крови и ее электрофоретическое фракционирование. Один раз в неделю осуществляли ЯМР и рентгенологический контроль первичной опухоли и метастазов. Через семь дней ввиду отсутствия изменений в содержании внеклеточной ДНК крови, ее электрофоретической картины и отсутствия реакции со стороны первичной опухоли и метастазов суточную дозу препарата увеличили до 100 мкг/кг. Ввиду отсутствия изменений еще через 7 дней произвели увеличение суточной дозы препарата до 150 мкг/кг. Через 2 дня после первого введения препарата в дозе 150 мкг/кг в препарате внеклеточной ДНК крови на фоне несущественного снижения общего количества внеклеточной ДНК крови (менее 20%) отмечалось существенное (более 50%) снижение содержания фракции внеклеточной ДНК крови с размером более 300 пар оснований. В последующие 4 дня самочувствие пациента значительно улучшилось, а по результатам контрольного ЯМР-исследования в конце семидневного цикла отмечалось уменьшение размера первичной опухоли на 25% и имелись рентгенологические признаки регрессии двух костных метастатических узлов.

Образцы внеклеточной ДНК данного больного, взятые до начала лечения и через 21 день после начала терапии, были клонированы с использованием метода, позволяющего конструировать неамплифицированные плазмидные библиотеки внеклеточной ДНК крови с представительностью до миллиона клонов со средним размером в 300-500 пар оснований.

Выделенная по ранее описанному протоколу ДНК была подвергнута дополнительной тщательной депротеинизации с применением протеиназы К (Sigma) при 65°С для удаления прочно связанных белков. После депротеинизации и однократной обработки фенол-хлороформом при 65°С, ДНК осаждали 2,5 объемами этанола в течение ночи. Затем ДНК либо обрабатывали рестриктазой EcoRI в течение 3 часов, либо Pfu полимеразой (Stratagene) в присутствии 300 мкМ всех дезоксинуклеотидтрифосфатов для удаления липких концов. Достроенную ДНК фосфорилировали полинуклеотидкиназой Т4 (30U, 2 ч). Полученные препараты лигировали в плазмиду pBluescript (Stratagene), переваренную EcoRI или PvuII соответственно и дефосфорилированную щелочной фосфатазой CIP (Fermentas) в течение 1 часа. Для лигирования обычно использовали 1 мкг вектора и 0,1-0,5 мкг сывороточной ДНК. Лигирование проводили при помощи Rapid Ligation Kit (Roche) 10 часов при 16°С. Объем лигазной смеси составлял 50 мкл. Лигированную библиотеку трансформировали в клетки DH12S (Life Technologies) с применением электропоратора Е.Coli porator (BioRad). Для трансформации одной библиотеки использовали 12-20 электропорационных кювет. Для контроля на чашки с 1,5% агаром и средой LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, высевали разведения библиотеки 10 -4, 10-5 и 10-6. В обоих случаях представительность библиотеки составляла примерно 2-3·10 6 клонов.

Анализ случайно выбранных 96 клонов с длиной от 300 до 1000 пар оснований из библиотеки, полученной из внеклеточной ДИК крови больного до начала лечения, показал, что 55 из 96 клонов представляют собой уникальные последовательности ДНК человека. Из 55 фрагментов уникальной ДНК функция или продукт соответствующего гена с помощью Human Gene Bank были идентифицированы для 15 последовательностей:

Таблица 3
Gene or corresponding protein product Reported role in cancerogenesis and cancer progression
G-protein coupled receptor protein Key role in neoplastic transformation,apoptosis inhibition, hormone independence and metastasis
Snf2 coupled CBP activator (SCARP) Transcription activator, reported in synovial sarcoma and leukemia.
SRY-box containing gene Transcription modulator expressed in embryogenesis. Reported in medulloblastoma, gonadal tumors, highly metastatic melanoma.
Tyrosine kinase Key role in cancer cell regulation network. Some class homologues are the products of cellular oncogenes.
Fibroblast activation protein, cell surface protease Involved into cancer invasion and metastasis.
Brain testican Reported in embryonic rhabdomyosarcoma.
KRAB domain, Zn-finger protein. Reported in early embryogenesis, neuroblastoma, Ewing sarcoma, T-cell lymphoma, linked with acquisition of drug resistance in lung cancer.
Melanoma associated antigen Antigen expressed in melanoma cells.
N-cadherin Involved into cancer invasion and metastasis.
Interleukin 7 Proposed essential autocrine-paracrine growth factor for many cancers
DEAD Box RNA helicaselike protein Expressed in highly proliferating and cancer cells.
Lipin-1 Involved into cancer cell response to cytotoxic drugs.
Dynein Participate in p53 intracellular traffic, reported in prostate cancer and hepatocellular carcinoma.
Ramp protein Reported in human embryonic carcinoma
Анализ случайно выбранных 100 клонов из библиотеки, полученной из внеклеточной ДНК крови больного через 21 день после начала лечения, показал, что более 90% выявленных последовательностей клонов представляют собой короткие фрагменты повторяющейся ДНК генома человека, в основном альфа сателлитную ДНК.

Таким образом, применение доз ДНКазы, достаточных для разрушения внеклеточной ДНК крови с размером более 300 пар оснований, ведет к исчезновению из внеклеточной ДНК крови уникальных фрагментов генома человека, в том числе вовлеченных в процесс формирования и поддержания злокачественного поведения раковых клеток. При этом наблюдается регрессия опухоли согласно заявляемому способу.

Пример 4. Лечение злокачественной низкодифференцированной лимфомы с диффузным поражением селезенки и ворот печени с метастатическими узлами в печени.

Женщина 49 лет поступила в клинику в тяжелом состоянии, с лихорадкой до 39°С, прогрессирующей желтухой и проявлениями печеночной недостаточности с подозрением на острый гепатит. При исследовании выявлена злокачественная низкодифференцированная лимфома с диффузным поражением селезенки и ворот печени с многочисленными метастатическими узлами в печени. С согласия больной, с учетом невозможности применения специфического лечения и постоянно прогрессирующей картины заболевания, ей была прописана внутривенная инфузия бычьей панкреатической ДНКазы. Два раза в сутки осуществляли измерение содержания внеклеточной ДНК крови и ее электрофоретическое фракционирование. В первые сутки было введено 500000 ЕД фермента в виде двух шестичасовых инфузий. В дальнейшем суточную дозу увеличивали на 1000000 ЕД в сутки ежедневно.

При достижении суточной дозы в 5500000 ЕД отмечено значительное (более 50%) снижение содержания внеклеточной ДНК крови и исчезновение фракции ДНК с размером более 300 пар оснований при электрофоретическом фракционировании. На фоне продолжающихся инфузий в дозе 5500000 ЕД в сутки состояние больной начало улучшаться, исчезли лихорадка и желтуха, улучшились биохимические показатели крови. Контрольное ультразвуковое исследование, проведенное на 20 день после начала лечения, выявило значительное (более 40%) сокращение площади поражения селезенки и исчезновение более половины метастатических узлов в печени. Больная была переведена в другое лечебное учреждение для проведения химиотерапевтического лечения.

Таким образом, применение доз ДНКазы, достаточных для разрушения внеклеточной ДНК крови с размером более 300 пар оснований ведет к регрессии опухоли согласно заявляемому способу.

Пример 5. Исследование влияния поликлональной сыворотки, содержащей антитела против ДНК, на рост карциномы Эрлиха у мышей, получающих лечение ДНКазой.

Антитела против ДНК выделялись из крови больных системной красной волчанкой по методике Shuster A.M. (Shuster A.M. et.al., Science, v.256, 1992, pp.665-667). Подобные анти-ДНК антитела способны не только связывать, но и осуществлять гидролиз ДНК. В качестве ДНКазы использовалась человеческая рекомбинантная ДНКаза I (Genetech).

1 группа - 7 мышей с привитой карциномой Эрлиха - контроль.

2 группа - 6 мышей с привитой карциномой Эрлиха, получивших на третий день после перевивки опухоли внутривенную инъекцию фракции человеческих анти-ДНК антител (IgG) по 200 мкг на одно животное. Животные также получали внутрибрюшинно терапию ДНКазой в дозе 0,5 мг/кг 4 раза в сутки с 3 по 7 день после перевивки.

3 группа - 6 мышей с привитой карциномой Эрлиха, получивших на третий день после перевивки опухоли внутривенную инъекцию фракции неспецифического человеческого иммуноглобулина (IgG) по 200 мкг на одно животное. Животные также получали внутрибрюшинно терапию ДНКазой в дозе 0,5 мг/кг 4 раза в сутки с 3 по 7 день после перевивки.

4 группа - 6 мышей с привитой карциномой Эрлиха получали внутрибрюшинно терапию ДНКазой в дозе 0,5 мг/кг 4 раза в сутки с 3 по 7 день после перевивки.

Эффект определяли по торможению роста опухоли на 7 день после перевивки (ТРО, выраженное в процентах)

Размер опухоли через 7 дней после перевивки приведен в таблице 4

Таблица 4
Группа Объем опухоли Т %
1 105+/-12 -
2 25+/-5 ˜75%
3 37+/-6 ˜66%
4 35+/-7 ˜67%
Приведенные данные свидетельствуют, что совместное применение ДНКазы и агента, связывающего внеклеточную ДНК крови, приводит к более выраженному противоопухолевому эффекту. Ниже приводим электрофоретический профиль внеклеточной ДНК плазмы крови мышей в группах 1, 2 и 3 через 7 дней после перевивки опухоли.

Группы: 2 1 3

Отчетливо заметно, что совместное применение анти-ДНК антител и ДНКазы приводит к более выраженному разрушению внеклеточной ДНК крови, что проявляется не только в снижении ее содержания, но и исчезновении более высокомолекулярных фракций.

Пример 6. Изучение кинетики деградации фракции высокомолекулярной фракции (размер более 300 пар оснований) внеклеточной ДНК крови больной раком молочной железы в присутствии бычьей панкреатической ДНКазы, Протеиназы К и бычьей панкреатической ДНКазы, Липазы и бычьей панкреатической ДНКазы и внеклеточной дезоксирибонуклеазы Serratia Mercenses, обладающей рибонуклеазной активностью и являющейся как разрушающим, так и модифицирующим агентом.

В образцы плазмы больной добавляли фермент и инкубировали 45 минут при 37°С. Через 45 минут реакцию прекращали и осуществляли выделение и электрофоретическое фракционирование с денситометрией внеклеточной ДНК крови. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5
Способ обработки % деградации высокомолекулярной фракции
Необработанный контроль 0
Протеиназа К (0,1 мкг/мл) 0
Панкреатическая липаза (0,1 мкг/мл) 0
Бычья панкреатическая ДНКаза (1 Kuntz Units/ml) 25
Бычья панкреатическая ДНКаза (1 Kuntz Units/ml) + Протеиназа К (0,1 мкг/мл) 35
Бычья панкреатическая ДНКаза (1 Kuntz Units/ml) + Панкреатическая липаза (0,1 мкг/мл) 40
Внеклеточная дезоксирибонуклеазы Serratia Mercenses (1 Kuntz Units/ml) 45
Приведенные данные свидетельствуют, что совместное применение ДНКазы и агента, модифицирующего связь внеклеточной ДНК крови с белками, липидами и рибонуклеиновыми кислотами, приводит к более эффективной деградации высокомолекулярной (более 300 пар оснований) фракции внеклеточной ДНК крови.

Пример 7. Изучение влияния различных способов разрушения внеклеточной ДНК на ее патогенные свойства.

Мыши С57В1 получили прививку высокометастатического или низкометастатического штамма опухоли LLC. На 9 день после перевивки животных усыпляли и собирали суммарную плазму крови мышей. Суммарная фракция внеклеточной ДНК крови после выделения хранилась при -20°С в фосфатном буфере.

В эксперименте участвовало 7 групп мышей, привитых низкометастатическим штаммом LLC.

1 группа - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC.

2 группа - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции внеклеточной ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворялись в 500 мкл свежей гепаринизированной крови).

3 группа - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворяли в 500 мкл свежей плазмы). Перед введением образец ДНК подвергали фотохимической дезинфекции (добавление 1 мкМ метиленового синего с последующим облучением красным светом в течение 10 минут (˜60000 Люкс)).

4 группа - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворяли в 500 мкл свежей плазмы). Перед введением образец ДНК смешивали с 10 мкг гидролитических анти-ДНК антител.

5 группа - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворяли в 500 мкл свежей гепаринизированной крови). Перед введением в образец добавляли 1 мкг фрагмента А растительного токсина Рицина и инкубировали 1 час при 37°С. Рицин является представителем семейства RIP (белки инактивирующие рибосомы) токсинов, широко используемых для создания иммунотоксинов. Кроме способности инактивировать рибосомы эти белки обладают способностью деаденилировать и гидролизовать ДНК. Для реализации токсического эффекта каталитическая единица А токсинов RIP II типа должна быть доставлена в клетку субъединицей В. В отсутствие субъединицы В цепь А не токсична, однако полинуклеотид-аденингликозидазная активность цепи А может быть использована для разрушения ДНК, циркулирующей в плазме.

6 группа - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворяли в 500 мкл свежей гепаринизированной крови. ДНК. Образец ДНК перед введением подвергалась ферментативному метилированию (I.Muiznieks et al., FEBS Letters, 1994, v.344, pp.251-254).

7 группа - 6 мышей мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции внеклеточной ДНК мышей, привитых низкометастатическим штаммом LLC.

8 группа - 6 мышей мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворяли в 500 мкл свежей гепаринизированной крови). Образец ДНК перед введением инкубировали в присутствии 200 нг/мл дорназы - альфа 30 минут при 37°С.

Оценивали количество метастатических узлов в легких на 15 день после перевивки.

Результаты эксперимента приведены в таблице 6.

Таблица 6
Группа Ncp.
1 12,0
2 22,5
3 14,1
4 15,5
5 15,1
6 12,3
7 13,3
8 13,5
Таким образом, внеклеточная ДНК крови мышей с высокозлокачественным штаммом опухоли усиливает метастазирование менее злокачественной опухоли. Разрушение, связывание и модификация внеклеточной ДНК крови препятствуют этому согласно заявляемому способу.

[AD]
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения злокачественных опухолей, отличающийся тем, что обеспечивают введение в кровь агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что агент, разрушающий внеклеточную ДНК крови, вводят в дозах, обеспечивающих изменение электрофоретического профиля внеклеточной ДНК крови, выявляемое пульс-гельэлектрофорезом.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что агент, разрушающий внеклеточную ДНК крови, вводят в дозах и режимах, обеспечивающих уровень ДНК-гидролитической активности плазмы крови, измеряемый в плазме крови и превышающий 150 единиц Кунца на литр плазмы, на протяжении суммарно более 12 ч в сутки.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что лечение осуществляют непрерывно не менее 2 суток.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве агента, разрушающего внеклеточную ДНК крови, используют фермент ДНКазу.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что используют бычью панкреатическую ДНКазу, которую вводят парэнтерально в дозах от 50000 единиц Кунца до 250000000 единиц Кунца в сутки ежедневно на протяжении 5-360 дней.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что используют рекомбинантную человеческую ДНКазу.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что используют рекомбинантную человеческую ДНКазу I (дорназу-альфа), которую вводят парэнтерально в дозах 0,15-500 мг/кг массы тела в сутки ежедневно на протяжении 5-360 дней.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что лечение проводят пожизненно.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно обеспечивают введение в кровь агента, связывающего внеклеточную ДНК крови.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве агента, связывающего внеклеточную ДНК крови, используют анти-ДНК антитела.