https://iemspb.ru/wp-content/uploads/20 ... eferat.pdfАвтореферат: СУВОРОВА Мария Александровна
ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ ДЕЙСТВИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ
ШТАММОВ STREPTOCOCCUS PYOGENES В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ
МОДЕЛЯХ IN VIVO И IN VITROОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Несмотря на то, что за последнее время
достигнут существенный прогресс в области терапии онкологических
заболеваний, они продолжают оставаться одной из наиболее распространенных
причин смерти в развитых странах. Общепринятые методы, такие как лучевая и
химиотерапия, не дают полного излечения, что обуславливает необходимость
поиска новых альтернативных методов, одним из которых является лечение
опухолей с применением микроорганизмов.
Патогенетические особенности опухолей позволяют им «ускользать» от
действия макрофагов и других клеток системы врождённого иммунитета,
поэтому одной из магистральных линий поиска способов терапии опухолей
является изучение возможностей стимуляции воспалительного процесса и
активации клеток его реализующих для лечения злокачественных образований.
Для этой цели используют живые, аттенуированные или генетически
модифицированные бактерии, которые обладают прямым цитотоксическим
эффектом и оказывают воздействие на клетки иммунной системы [Jessy, 2011].
Изучение способов и механизмов реализации эффектов действия клеток и
веществ с противоопухолевой активностью является важнейшей задачей
современной патофизиологии.
Особый интерес вызывает применение для этих целей бактерий
Streptococcus pyogenes и продуктов их жизнедеятельности [Hoption Cann, 2003].
Эти бактерии являются хорошо изученными патогенными микроорганизмами,
выделяемыми исключительно из образцов биологического материала человека.
Известно, что S. pyogenes могут проявлять как прямые, так и опосредованные
цитолитические воздействия на эукариотические клетки, обусловленные
наличием различных ферментов и токсинов [Forbes, 2006]. Существенным
преимуществом использования S. pyogenes является высокая чувствительность
стрептококков к пенициллину, которая позволяет легко уничтожить их после
терапевтического применения. При этом S. pyogenes могут длительное время
существовать в тканях, плохо снабжаемых кислородом, в том числе в
злокачественных новообразованиях [Forbes, 2006]. Необходимо отметить, что S.
pyogenes относятся к микроорганизмам, которые могут быть подвергнуты
генно-инженерной модификации, что позволяет инактивировать отдельные
гены для изучения их свойств. Таким образом, S.pyogenes являются
4
перспективными микроорганизмами для создания на их основе новых подходов
к противоопухолевой терапии.
Степень разработанности темы. S. pyogenes стал впервые использоваться в
клинической практике для терапии злокачественных опухолей в конце 19 века
американским хирургом W.Coley [Nauts, 1953]. Coley отмечал, что наилучшего
результата ему удавалось достигнуть, когда в ходе терапии у пациента
развивался мощный воспалительный процесс. Для клинического применения
был разработан и активно применялся так называемый “токсин Коли”, который
представлял собой фильтрат термически обработанных S. pyogenes, не
содержащий живых бактерий. В 50-60-ых годах XX века было опубликовано
несколько статей по применению фильтратов S. pyogenes (“токсина Коли”) для
лечения экспериментальных опухолей, в которых было показано, что саркома
S37 у мышей является опухолью, чувствительной к данному методу терапии
[Havas, 1958]. В начале XXI века была опубликована монография, обобщившая
успешный многолетний опыт применения S. pyogenes штамма «Гуров» в
клинической практике для терапии онкологических заболеваний на базе
Пермского государственного медицинского университета [Черешнев В.А.
2006]. Позднее была продемонстрирована успешная возможность лечения
опухоли поджелудочной железы у мышей после однократного введения живой
культуры S. pyogenes M49 серотипа штамм №591 внутрь опухоли [Maletzki,
2008]. Предполагают, что этот эффект обусловлен ответом организма на
патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), присутствующие
на микроорганизмах, что может усиливать противоопухолевую защиту
организма. Однако, механизмы противоопухолевого действия S. pyogenes до
сих пор недостаточно ясны.
При этом также было показано, что живые бактерии оказались более
эффективными, чем убитые S. pyogenes [Maletzki, 2008]. Эти данные
доказывают необходимость сохранять жизнеспособность S. pyogenes. Синтез
микроорганизмами широкого набора биологически активных веществ,
включающих токсины и разнообразные ферменты, в физиологически активном
состоянии обуславливает более выраженное противоопухолевое действие
живых бактерий. В частности, показано, что стрептококковый фермент –
аргининдеиминаза способен в существенной степени замедлять развитие
большой группы опухолевых клеток [Feidler, 2015]. Однако существенным
5
недостатком такого рода терапии является высокая токсичность S. pyogenes. С
целью снижения потенциальной опасности живых стрептококков для
организма нами была поставлена задача сконструировать штамм S. pyogenes,
лишенный М-белка – одного из главных факторов патогенности стрептококков.
Цель исследования. Изучить противоопухолевое действие модифицированных
штаммов S. pyogenes на экспериментальных моделях in vivo и in vitro и
обосновать новые подходы к терапии опухолей с использованием
модифицированных бактерий.
Задачи исследования:
1. Для снижения вирулентности живых S. pyogenes штамма «Гуров»,
используемых при лечении опухолей в эксперименте, получить и
охарактеризовать новый мутантный штамм с инактивированным геном Мбелка (emmˉ).
2. Провести сравнительный анализ генетических различий между штаммами
Гуров» и «Гуров» emmˉ (GURSA1) с помощью полногеномного
секвенирования.
3. Оценить динамику опухолевого роста и выживаемость у мышей с
перевиваемыми опухолями - гепатомой 22а и саркомой S37 при введении
штаммов S. pyogenes «Гуров» и «Гуров» emmˉ (GURSA1).
4. Сравнить прямое цитотоксическое воздействие исходного штамма S.
pyogenes «Гуров» и его мутанта «Гуров» emmˉ (GURSA1) на клетки гепатомы
22а in vitro.
5. Исследовать функциональную активность перитонеальных макрофагов
интактных мышей в системе in vitro в ответ на воздействие штаммов S.
pyogenes «Гуров» и «Гуров» emmˉ (GURSA1).
6. Изучить рост клеток гепатомы 22а в условиях in vitro и выживаемость мышей
с саркомой S37 при воздействии штамма S. pyogenes М49-16 с
инактивированным геном аргининдеиминазы.
Научная новизна исследования. Впервые получен и охарактеризован новый
штамм S. pyogenes с инактивированным геном М-белка, обладающий
противоопухолевой активностью в отношении перевиваемых опухолей мышей
in vivo и in vitro. В результате полногеномного секвенирования штамма S.
pyogenes «Гуров» установлено, что штамм «Гуров» относится к серотипу М111,
а не к серотипу М39, как считалось ранее; получены ранее неизвестные данные
6
о строении Mga регулона М111 серотипа. Впервые показано, что инактивация
белка М-белка 111 серотипа приводит к повышению адгезивной способности S.
pyogenes в отношении клеток гепатомы 22а мышей. Также впервые показано,
что инактивация гена белка М111 приводит к снижению антифагоцитарных
свойств стрептококков в отношении резидентных перитонеальных макрофагов
интактных мышей. Кроме того, инактивация гена белка М111 влияет на
способность стрептококков индуцировать синтез цитокинов и усиливать
продукцию активных форм кислорода перитонеальными макрофагами
интактных мышей. Впервые показан противоопухолевый эффект
аргининдеиминазы, продуцируемой S. pyogenes М 49 серотипа, на модели
перевиваемой саркомы S37 мышей in vivo.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Для проведения экспериментов по изучению противоопухолевой активности
живых S. pyogenes получен и охарактеризован новый изогенный мутант штамма
«Гуров» с инактивированным геном М-белка «Гуров» emmˉ (GURSA1).
2. Наличие единичной вставки интегративной плазмиды в области кодирования
гена emm, обнаруженной при сравнительном полногеномном секвенировании
исходного штамма S. pyogenes «Гуров» и его мутанта «Гуров» emmˉ (GURSA1),
доказывает, что целостность генома мутантного штамма в других областях не
нарушена.
3. На моделях перевиваемых опухолей у мышей продемонстрировано
подавление опухолевого роста при введении живых бактерии S. pyogenes
штамма «Гуров» emmˉ (GURSA1) по сравнению с исходным штаммом «Гуров».
4. Бактерии штамма S.pyogenes «Гуров» emmˉ (GURSA1) обладают более
выраженным прямым цитотоксическим действием в отношении клеток
гепатомы 22а in vitro по сравнению с исходным штаммом «Гуров».
5. Стимулирование продукции активных форм кислорода в резидентных
перитонеальных макрофагах бактериями S. pyogenes штамма «Гуров» emmˉ
(GURSA1), в отличие от исходного штамма «Гуров» можно рассматривать как
один из механизмов противоопухолевого действия этих бактерий.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Представленная
диссертационная работа является фундаментальным научным исследованием,
результаты которого вносят вклад в изучение прямого и опосредованного
цитотоксического воздействия S. pyogenes на злокачественные перевиваемые
7
опухоли у животных. Работа носит экспериментальный характер. Результаты
исследования создают основу для дельнейшего изучения механизмов
противоопухолевого действия живых S. pyogenes как потенциальных средств
терапии опухолевых заболеваний человека. Заявка на изобретение №
2016152829 от 30.12.2015 принята и проходит экспертизу по существу. Штамм
S. pyogenes «Гуров» emmˉ был депонирован нами и находится в коллекции
патогенных штаммов ФБУН ГНУ ПМБ (Оболенск).
Личное участие автора в получении результатов. Автором, совместно с
научными руководителями, были спланированы и лично выполнены все
экспериментальные исследования in vitro и in vivo, а также проведена
статистическая обработка данных. В постановке и решении конкретных задач,
организации и выполнении исследований, обработке и интерпретации
полученных результатов автору принадлежит ведущая роль.
Публикации по материалам исследования. По теме диссертации
опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 публикации в рецензируемых
изданиях, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки
Российской Федерации, 1 в зарубежном журнале. Принята заявка №
2016152829 от 30.12.2015 на изобретение, проходит экспертизу по существу.
Штамм «Гуров» emmˉ (GURSA1) депонирован в коллекции патогенных
штаммов ФБУН ГНУ ПМБ (Оболенск).
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов, полученных при проведении экспериментов, подтверждается
достаточным и репрезентативным объёмом выборки выполненных наблюдений
и контрольных исследований и подтверждена адекватными методами
статистической обработанных. Методы математической обработки полученных
результатов соответствуют поставленным задачам. Материалы диссертации
доложены на XXI, XXII, XXIV, XXVI конгрессах европейского клинического
микробиологического общества ECCMID (Милан, Италия, 2011 г.; Лондон,
Великобритания, 2012 г., Барселона, Испания, 2014, Амстердам, Нидерланды.
2016), на конференции “Современная диагностика и лечение стрептококков
группы А в клинической практике” (Рим, Италия 2013), XIX конгрессе им.
Ленсфильд по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям (Буэнос-Айрес,
Аргентина, 2014), на X, XIV и XV Всероссийских научных форумах с
международным участием им. акад. В.И. Иоффе “Дни иммунологии в Санкт-
8
Петербурге” (Санкт-Петербург, Россия 2011, 2015,), на конференции
«Клеточные и молекулярные механизмы взаимоотношения опухоли и
микроокружения» (Томск, Россия, 2015 г.), на II и III Петербургских
международных онкологический форумах «Белые ночи 2016» и «Белые ночи
2017». ...
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Для проведения экспериментов по изучению противоопухолевой
активности живых S. pyogenes в работе был впервые получен и охарактеризован
штамм S. pyogenes «Гуров» М111 серотипа с инактивированным М-белком -
«Гуров» emmˉ (GURSA1). Достоверность полученного клона была
подтверждена методом ПЦР, секвенированием генома в участке интеграции
плазмиды, а потом и полногеномным секвенированием как исходного штамма
«Гуров», так и его эритромицин-устойчивого варианта с интеграцией плазмиды
в область гена emm. Показано, что интеграция носит стабильный характер, а
полученный штамм сохраняет групповую принадлежность.
При исследовании противоопухолевой активности мутантного emmˉ
штамма мы наблюдали сдерживание опухолевого роста как по отношению к
контрольной группе, так и в отношении группы животных, которым вводили
исходный штамм «Гуров» на обеих использованных экспериментальных
моделях. При этом выживаемость мышей при введении штамма «Гуров» emm
–
(GURSA1) была достоверна выше по сравнению с контрольной группой и с
группой животных, которым вводили исходный штамм «Гуров», только при
росте гепатомы 22а и не изменялась при росте саркомы S37.
При изучении возможного механизма противоопухолевого действия
мутантного штамма «Гуров» emmˉ (GURSA1) показано, что он обладает более
выраженным прямым цитотоксическим эффектом по сравнению с исходным
штаммом в отношении клеток гепатомы 22а in vitro. Возможно, это было
связано с увеличением адгезивной способности мутантного штамма в
отношении этих клеток. В нашей работе впервые показано, что белок М111
обладает не только анти-адгезивными свойствами в отношении клеток
гепатомы 22а, но также и анти-фагоцитарными – в отношении резидентных
перитонеальных макрофагов.
Также нами была проверена возможность непрямого противоопухолевого
21
действия штамма S. pyogenes «Гуров» emmˉ (GURSA1), связанная с
иммуномодулирующим воздействием на макрофаги. Показано, что удаление
М-белка в штамме S. pyogenes «Гуров» emm
–
(GURSA1) приводит к следующим
иммуномодулирующим эффектам в отношении макрофагов: усилению
продукции супероксид анионов и снижению продукции IL-10 и IL-17. Все три
эффекта можно рассматривать как позитивные с точки зрения
противоопухолевой защиты. Усиление продукции супероксид анионов может
способствовать цитотоксическому действию макрофагов в отношении
опухолевых клеток; подавление продукции ангиогенного цитокина IL-17 может
сдерживать рост опухолевого узла, а снижение (по сравнению с исходным
штаммом) продукции IL-10 уменьшит его иммунодепрессивное влияние.
Можно предположить, что данные эффекты являются одним из
механизмов противоопухолевого действия штамма S. pyogenes «Гуров» emm
–
(GURSA1) в организме мышей-опухоленосителей, а наблюдаемая нами при
введении мутантного штамма задержка опухолевого роста может быть связана
не только с его прямым цитотоксическим воздействием на опухолевые клетки,
но и с его иммуномодулирующим действием, а именно, влиянием на
функциональную активность внутриопухолевых макрофагов.
Таким образом, полученный нами штамм S. pyogenes «Гуров» emm
–
(GURSA1) оказывает выраженный противоопухолевый эффект и может быть
использован для последующего изучения механизмов его действия. На
основании полученных данных может в дальнейшем разрабатываться новая
стратегия противораковой терапии, связанная с применением живых
модифицированных S. pyogenes с инактивированными генами вирулентности.
22
ВЫВОДЫ
1. С помощью инсерционного мутагенеза получен и охарактеризован новый
штамм S. pyogenes с инактивированным геном М-белка - «Гуров» emmˉ
(GURSA1).
2. С помощью полногеномного секвенирования штамма S. pyogenes «Гуров» и
его мутанта «Гуров» emmˉ (GURSA1) показано, что инактивация гена М-белка
произошла в результате встройки интегративной плазмиды в область гена emm
в единственной копии на геном и не нарушает целостность генома в других
областях.
3. Внутриопухолевое введение штамма «Гуров» emmˉ (GURSA1) вызывает
задержку роста перевиваемых опухолей гепатомы 22а (p<0,001) и саркомы S37
у мышей (p<0,05) и повышает выживаемость животных с гепатомой 22а по
сравнению с введением исходного штамма «Гуров» (по критерию Гехана
p<0,01).
4. Штамм «Гуров» emmˉ (GURSA1) оказывает более выраженное прямое
цитотоксическое действие (p<0,001) и более высокую адгезивную способность
(p<0,001) в отношении клеток гепатомы 22а in vitro по сравнению с исходным
штаммом «Гуров».
5. Добавление штамма «Гуров» emmˉ (GURSA1) в культуру перитонеальных
макрофагов интактных мышей повышает противоопухолевую активность этих
клеток – стимулирует в них образование активных форм кислорода и
уменьшает продукцию ими протуморогенных цитокинов IL-10, IL-17 по
сравнению с исходным штаммом «Гуров».
6. Инактивация гена аргининдеиминазы в штамме S. pyogenes M49-16 вызывает
снижение противоопухолевого эффекта по сравнению с исходным штаммом в
отношении клеток гепатомы 22а in vitro и перевиваемой саркомы S37 in vivo.
7. Комплекс приведенных данных расшифровывает патофизиологические и
микробиологические основы противоопухолевого действия живых S. pyogenes
штамма «Гуров» emmˉ (GURSA1), обусловленные характером их
взаимодействия с клетками опухоли и с системой врожденного иммунитета, что
обосновывает перспективность создания новых препаратов для терапии
опухолей.
23
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:
1. Суворова М.А., Крамская Т.А., Дуплик Н.В., Черешнев В.А., Грабовская
К.Б., Ермоленко Е.И., Суворов А.Н., Киселева Е.П. Влияние инактивации
гена М-белка на противоопухолевые свойства живых Streptococcus
pyogenes в эксперименте //Вопросы онкологии. - 2017. - Т.63, №5. - С. 65-
69.
2. Суворова М.А., Крамская Т.А., Суворов А.Н., Киселева Е.П. Инактивация
гена белка М111 влияет на взаимодействие Streptococcus pyogenes c
макрофагами мышей in vitro //Бюллетень экспериментальной биологии и
медицины. - 2017. - Т.164, №9. - С.330-334.
3. Суворова М.А., Цапиева А. Н., Дуплик Н. В., Крамская Т. А., Грабовская
К. Б., Киселёва Е. П., Черешнев В. А., Суворов А. Н. Конструирование
штамма стрептококка, мутантного по М-белку //Медицинский
академический журнал. - 2016. - Т.16, №4. - С.235-236.
4. Суворова М.А., Крамская Т.А., Карасева А.Б., Мухин В.Н., Ермоленко
Е.И., Суворов А.Н. Инактивация гена аргининдеиминазы стрептококков
снижает степень их противоопухолевой активности in vitro и in vivo
//Медицинский академический журнал. - 2017. - Т.17, №1. - С.96-101.
Зарубежные публикации:
Suvorova M., Tsapieva A., Bak E, Chereshnev V., Kiseleva E., Suvorov A.,
Arumugam М. Complete genome sequences of emm111 type Streptococcus
pyogenes strain GUR with anti-tumor activity and it’s derivate strain GURSA1
with inactivated emm gene //Genome Announcements. - 2017. - Vol. 5, Issue
38. - e00939-17. doi:10.1128/genomeA.00939-17.
Тезисы докладов:
1. Суворова М.А., Потатуева О.О., Киселева Е.П. Цитотоксическое действие
штаммов стрептококков группы А серотипа М49 на гепатому 22а мышей.
Медицинская иммунология. 2011. Т.13 № 4-5, С.335-336.
2. Suvorova M., Potatueva O., Kiseleva E. Cytotoxic effect of group A
streptococci on murine hepatoma 22a. Abstract Conf.: “Current diagnostics and
therapeutic dilemmas in clinical management of group A streptococcal
infections”. 21-23 March 2013, Rome, Italy, p. 119.
3. Suvorova M., Puzyreva V., Tcapieva A., Suvorov A., Kiseleva E. Antitumor
activity of M- protein mutant Streptococcus pyogenes strains on transplantable
murine hepatoma 22a. Abstr. XIX Lancefield symposium on streptococci and
streptococcal diseases, Buenos-Aires, Argentina, 9-12 November 2014, p.262.